兔VX2肝癌模型動(dòng)態(tài)量化磁共振灌注成像與病理的對(duì)照研究.pdf

1、目的及意義 肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcarinoma，HCC)為我國(guó)原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，死亡率較高，近年來(lái)發(fā)病率有上升趨勢(shì)，但目前其病因及發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚。 作為磁共振技術(shù)的最新成就，磁共振灌注成像(perfusionweightedimaging，PWI)是近年發(fā)展的功能成像技術(shù)，已成功應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的臨床診斷和相關(guān)病變的基礎(chǔ)研究，但其在肝臟方面的實(shí)驗(yàn)研究，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均較少

2、見(jiàn)。 資料與方法 1、實(shí)驗(yàn)資料： 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組： 新西蘭大白兔20只，體重2-3kg，雌雄不限，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組共四組，每組4只，對(duì)照組共四組，每組1只。 1.2接種用VX2細(xì)胞株及改良型兔VX2肝癌模型的制備： 荷瘤VX2新西蘭種兔1只(中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院惠贈(zèng))，將瘤細(xì)胞接種于兔大腿部皮下成瘤并傳代，選取2周左右種兔切除

3、腫瘤，在平皿上制成1-2mm3大小碎塊，用18G針頭針筒抽吸作為瘤種備用。 將實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔采用3％戊巴比妥鈉(1ml/kg)靜脈麻醉，仰臥固定于CT檢查床并CT定位，在CT引導(dǎo)下，用穿刺針在兔的肝臟注入已準(zhǔn)備好的瘤株，量為含2-3個(gè)左右的組織塊，針尖刺入深度1.5-2.0cm左右，為保證種植的成功率，在兔肝臟左、右葉各種植一個(gè)瘤灶，隨后用由兔自身靜脈血所致血凝塊封堵針道，CT掃描確定無(wú)活動(dòng)性出血后，待種植兔復(fù)蘇，送回動(dòng)物房

4、繼續(xù)飼養(yǎng)。 1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理： 在實(shí)驗(yàn)組新西蘭大白兔植入腫瘤后14d、18d、22d、26d，分別將一組實(shí)驗(yàn)組兔及一組對(duì)照組兔用3％的戊巴比妥鈉注射麻醉，使兔俯臥、固定于磁共振掃描儀8通道膝關(guān)節(jié)掃描線圈中，行磁共振平掃、增強(qiáng)掃描及磁共振灌注成像；掃描完畢后，立即采用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行大體病理結(jié)果及免疫組化的量化結(jié)果與磁共振成像的量化結(jié)果綜合對(duì)照分析。 2、磁共振掃描方法：所用儀器為美國(guó)GE公司新型1

5、.5TTwinSpeed雙梯度磁共振掃描儀，平掃采用SE序列T1WI:TR/TE=400ms/15ms，層厚為5.0mm，間隔1.0mm，層數(shù)為10-12，視野為16cm×16cm，矩陣為256×192，NEX為4，成像時(shí)間為3min18s；T2WI采用FSE序列：TR/TE=3500ms/75ms，層厚為5.0mm，間隔1.0mm，層數(shù)為10-12，視野為16cm×16em，矩陣320×192，NEX為4，成像時(shí)間為3min40s。

6、 3、磁共振掃描結(jié)果的測(cè)量及方法 把所有掃描圖像傳至工作站，采用GE公司圖像處理軟件，版本為AdvantageWorkatationAW4.005，數(shù)據(jù)測(cè)量及分析采用Functool軟件進(jìn)行，分別分析平均強(qiáng)化時(shí)間(Meantimetoenhance,MTE)、最大增強(qiáng)斜率(Maximumslopeofincrease,MSI)的變化規(guī)律；繪制時(shí)間-信號(hào)強(qiáng)度曲線(signalintensitytimecurve，SI-T曲線

7、)、生成MTE圖及MSI圖，MTE圖及MSI圖的偽彩顏色均表示每個(gè)體素的參數(shù)測(cè)量值，由大到小分別顯示為紅色、黃色、綠色、藍(lán)色、黑色。 正常對(duì)照組測(cè)量方法：盡量避開(kāi)血管、膽管結(jié)構(gòu)和圖像偽影，每次測(cè)量選用2個(gè)以上圓形感興趣區(qū)(ROI)，每個(gè)感興趣區(qū)面積應(yīng)大于20±5mm2，并覆蓋多于50個(gè)像素；進(jìn)行量化研究的數(shù)據(jù)為多個(gè)感興趣區(qū)所測(cè)值數(shù)據(jù)的平均值。 病灶測(cè)量方法：盡量避開(kāi)血管、膽管及偽影，在病灶直徑最大的層面上測(cè)量；每次測(cè)量選

8、用2個(gè)圓形感興趣區(qū)(ROI)，每個(gè)感興趣區(qū)面積應(yīng)大于20±5mm2，并覆蓋多于50個(gè)像素；進(jìn)行量化研究的數(shù)據(jù)為2個(gè)感興趣區(qū)所測(cè)數(shù)據(jù)的平均值。 4、大體病理標(biāo)本的制作及結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)完畢后，立即處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，整體摘取肝臟，肉眼觀察每層標(biāo)本有無(wú)腫瘤組織、腫瘤切面形態(tài)、色澤等，有無(wú)癌旁子灶及其大小、形態(tài)和數(shù)目；然后將解剖標(biāo)本用10％福爾馬林浸泡、固定，常規(guī)石蠟包埋，切成厚4um切片，制成常規(guī)HE染色切片及各種免疫組化切片。

9、 5、VEGF檢查的標(biāo)本的制作及結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)： 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子檢測(cè)采用鏈霉素-生物素-過(guò)氧化酶連接法(streptavidin-biotin-peroxidase,SP法)進(jìn)行免疫組化染色，(diaminobenzidinetertrahydrochloride.DAB,二甲基氨聯(lián)苯胺)顯色試劑盒，進(jìn)行VEGF的檢測(cè)和量化分析，所用試劑盒均購(gòu)自Roche公司。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，用已知陽(yáng)性標(biāo)本做陽(yáng)

10、性對(duì)照，對(duì)照組有磷酸緩沖液(PBS)代替一抗。 6、統(tǒng)計(jì)分析： 量化結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在SPSSWindow13.0統(tǒng)計(jì)軟件上進(jìn)行，其結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。各組參數(shù)均經(jīng)過(guò)方差分析及基于方差分析的多重比較的方法，P＜0.05認(rèn)為組間有顯著性差異。 結(jié)果 1、大體病理及HE染色病理結(jié)果： 所有對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟均未見(jiàn)腫瘤及其它異常病理改變。 四組實(shí)驗(yàn)組共16只新西蘭大白兔均成功長(zhǎng)出腫瘤；在

11、第14d、18d、22d、26d動(dòng)態(tài)測(cè)量共計(jì)26個(gè)瘤灶，分別為4個(gè)、11個(gè)、6個(gè)、5個(gè)瘤灶；大小范圍為0.3cm-3.9cm，所測(cè)瘤灶位于肝左葉16個(gè)，肝右葉10個(gè)，實(shí)驗(yàn)組兔肝臟的瘤灶表現(xiàn)為單發(fā)10只，多發(fā)6只。 實(shí)驗(yàn)組兔在腫瘤植入后第14d、18d、22d、26d的病理HE染色結(jié)果總結(jié)為：種植時(shí)間較短的癌細(xì)胞呈巢狀、梁索狀排列，結(jié)構(gòu)尚清楚；隨著腫瘤種植時(shí)間的延長(zhǎng)，瘤細(xì)胞增生更加活躍，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目增多，排列緊密，雜亂，核分裂增

12、加；腫瘤組織出現(xiàn)大小不一的灶性或片狀壞死；癌組織間出現(xiàn)血管和纖維結(jié)締組織增生，形成粗細(xì)不一、大小不等的條索狀、束狀，分布于巢狀、條索狀等癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間，部分切片可見(jiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)纖維包膜，并向肝組織播散，形成肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。 2、VEGF切片的光鏡觀察結(jié)果(高倍鏡，×200倍) VEGF陽(yáng)性染色多位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核的周圍，明顯呈棕褐色；癌旁肝組織及對(duì)照組正常肝組織呈陰性，未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，均無(wú)陽(yáng)性染色。隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)，癌細(xì)胞的V

13、EGF數(shù)量有逐漸增多、豐富的趨勢(shì)。 3、VEGF的量化分析結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)組兔肝臟腫瘤病變及對(duì)照組兔肝臟的VEGF，在第14d、18d、22d、26d分別為：實(shí)驗(yàn)組0.967±0.058，1.233±0.367，1.383±0.117，1.500±±0.208；對(duì)照組為0。 統(tǒng)計(jì)分析表明，在第14d、18d、22d、26d，實(shí)驗(yàn)組兔肝臟瘤灶與對(duì)照組兔肝臟組織的VEGF的F值為50.857，P值為0.000，差異有非常

14、的顯著性。總體比較四組間的實(shí)驗(yàn)組兔肝臟瘤灶VEGF差異不顯著，但實(shí)驗(yàn)組組間VEGF測(cè)定14d組與22d組、26d組間存在顯著的差異，P＜0.05，18天組與26d組間存在顯著的差異，P＜0.05。 4、磁共振平掃及增強(qiáng)圖像： 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均成功進(jìn)行磁共振掃描。所有對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在T1WI、T2WI及增強(qiáng)掃描動(dòng)態(tài)各時(shí)期的掃描中均未見(jiàn)異常；磁共振成像在不同時(shí)期共實(shí)際動(dòng)態(tài)測(cè)量實(shí)驗(yàn)組兔共計(jì)16個(gè)瘤灶，分別為4個(gè)、5個(gè)、3個(gè)、4個(gè)

15、瘤灶；大小范圍為0.3cm-3.9cm。 主要結(jié)論 兔VX2肝癌模型選擇14d、18d、22d、26d作為觀測(cè)點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)量化研究的實(shí)驗(yàn)研究表明： 1、大體和免疫病理分析： 病理組織學(xué)分型多為梁索型、Edmonson-Steiner細(xì)胞分化程度多為Ⅲ級(jí)；隨著腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，瘤內(nèi)凝固性壞死和纖維增生、包膜浸潤(rùn)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移呈明顯遞增趨勢(shì)，其中凝固性壞死較纖維增生為早出現(xiàn)。 隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)，VE

16、GF的陽(yáng)性細(xì)胞染色逐漸增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組兔肝臟瘤灶與對(duì)照組兔肝臟組織的VEGF差異有顯著性；實(shí)驗(yàn)組兔肝臟瘤灶VEGF數(shù)量呈遞增趨勢(shì)。 2、磁共振平掃及增強(qiáng)掃描成像與病理對(duì)照： 實(shí)驗(yàn)組兔隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤的壞死、纖維化越明顯，磁共振平掃信號(hào)不均勻，強(qiáng)化越不均勻，與病理組織學(xué)的改變基本一致，因此腫瘤的磁共振平掃信號(hào)改變、增強(qiáng)形式的變化一定程度上可反映病理組織學(xué)的變化。 3、磁共振灌注成像量化分析： 隨著種植時(shí)

17、間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組兔肝臟瘤灶內(nèi)的凝固性壞死和纖維增生的時(shí)序改變導(dǎo)致了灌注成像的MTE值呈遞增趨勢(shì)；MSI值呈遞減趨勢(shì)。PWI的MTE、MSI與VEGF有相同的變化趨勢(shì)，MTE、MSI其變化在一定程度上反映VEGF的變化，從而可間接反映腫瘤血管生成的變化。磁共振PWI的量化指標(biāo)能夠從血流動(dòng)力學(xué)功能成像的角度較磁共振平掃及增強(qiáng)掃描成像，提供更為豐富的信息。 本研究表明，通過(guò)兔VX2肝癌模型動(dòng)態(tài)PWI的MTE、MSI的量化分析，證明PW