抗病毒治療中HBV基因型轉(zhuǎn)換機(jī)制及臨床意義研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染是公認(rèn)的全球性疾病，對(duì)其感染的控制和清除，仍然是21世紀(jì)公共健康問題的一大挑戰(zhàn)。目前，對(duì)于丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染的基因型判定已成為治療的重要提示，而HBV基因型是否會(huì)影響抗病毒治療效果，HBV基因型與藥物反應(yīng)性的關(guān)系如何，仍然撲朔迷離。近些年，隨著核苷類似物大量長期使用，在HBV抗病毒治療過程中發(fā)生不同基因型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象時(shí)有報(bào)道，但其發(fā)生的機(jī)制與

2、潛在的臨床意義，卻未能引起足夠的重視。我們前期研究提示，由于HBV基因型混合感染可能是普遍現(xiàn)象，并以一種基因型占絕對(duì)優(yōu)勢的形式存在，當(dāng)選擇壓力出現(xiàn)時(shí)，不同基因型對(duì)選擇壓力存在敏感性的差異，最終導(dǎo)致基因型轉(zhuǎn)換的發(fā)生。因此，我們就需要建立高靈敏度的基因分型檢測方法，以闡明基因型轉(zhuǎn)換這一臨床現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制及其臨床意義，研究結(jié)果將對(duì)臨床個(gè)體化治療具有潛質(zhì)應(yīng)用前景。
　　目的：通過建立高靈敏度基因分型檢測方法，闡明抗病毒治療中HBV基因型轉(zhuǎn)

3、換的機(jī)制，結(jié)合病毒學(xué)、免疫學(xué)、生化學(xué)檢測指標(biāo)，探討基因型轉(zhuǎn)換與抗病毒藥物療效之間的關(guān)系及臨床意義。
　　方法：本研究中，我們將小溝結(jié)合探針（MGB）和肽核酸（PNA）封閉探針聯(lián)用的新策略應(yīng)用于熒光定量PCR檢測平臺(tái)，建立了一種高靈敏的HBV基因型型特異熒光定量PCR檢測法；同時(shí)，還構(gòu)建了基于深度測序技術(shù)的大樣本平行測序HBV基因型檢測法，這兩種方法均能大幅度提高不同基因型混合感染的檢出率，高靈敏度的定性定量基因分型數(shù)據(jù)為闡明基因型

4、轉(zhuǎn)換的本質(zhì)提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。隨后，我們對(duì)38例阿德福韋（AdefovirdDipivoxil,ADV）治療一年患者的基因型與HBV病毒載量、HBeAg水平及肝功能水平等進(jìn)行了縱向研究，從基因型混合感染是前提，選擇壓力是必要條件，不同基因型對(duì)藥物敏感性的差異是關(guān)鍵三個(gè)層面，闡明了抗病毒治療中HBV基因型轉(zhuǎn)換的本質(zhì)，并結(jié)合臨床檢測數(shù)據(jù)，探討了基因型轉(zhuǎn)換的臨床意義。
　　結(jié)果：Sanger測序結(jié)果顯示，38例病人中有13例發(fā)生基因型

5、轉(zhuǎn)換，且主要是C型到B型的轉(zhuǎn)換。而深度測序結(jié)果顯示，所有發(fā)生基因型轉(zhuǎn)換的標(biāo)本在ADV治療前已經(jīng)是B和C型混合感染。進(jìn)一步用深度測序?qū)?00例臨床標(biāo)本檢測其混合感染的情況，結(jié)果混合感染比例高達(dá)95.5％（191/200）,其中僅12%的標(biāo)本混合感染比例>1%。深度測序結(jié)果提示中國人群中HBVB型和C型的混合感染是一種普遍現(xiàn)象。選擇壓力與基因型轉(zhuǎn)換關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果顯示，藥物反應(yīng)性好和HBeAg轉(zhuǎn)陰的患者更容易發(fā)生基因型轉(zhuǎn)換，并且對(duì)兩種選擇壓力

6、均敏感的患者，基因型轉(zhuǎn)換率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)兩者均不敏感的患者（50%vs20%），驗(yàn)證了選擇壓力對(duì)于基因型轉(zhuǎn)換的必要性。38例患者ADV治療前后基因型B和C的變化總量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，C型總量下降，B型上升，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），并且在38例患者中，治療前為C型的患者發(fā)生基因型轉(zhuǎn)換的頻率高于B型患者（P＜0.01），統(tǒng)計(jì)結(jié)果均支持C型對(duì)ADV更敏感，表明不同基因型對(duì)藥物敏感性的差異是基因型發(fā)生轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因素。最后，通過對(duì)38例

7、ADV治療乙肝患者的臨床資料分析表明，發(fā)生基因型轉(zhuǎn)換組較未轉(zhuǎn)換組，肝功能復(fù)常（ALT）的比例更高（P＜0.05），血清學(xué)轉(zhuǎn)換率（HBeAg）也更高（P＜0.01），HBVDNAload下降程度更大，總體治療效果更好，這也說明HBV基因型轉(zhuǎn)換研究具有重要的臨床意義。
　　總結(jié)：本研究建立了兩種高靈敏度的HBV基因分型檢測方法，對(duì)于混合感染中劣勢基因型的檢測具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確性，大大提高混合感染的檢出率，并均具備臨床大樣本的檢測能

8、力，適用于抗病毒治療過程中HBV基因型的動(dòng)態(tài)監(jiān)控。并圍繞基因型轉(zhuǎn)換這一臨床現(xiàn)象，以ADV抗病毒治療臨床研究隊(duì)列為回顧性研究對(duì)象，采用已建立的高靈敏度基因分型方法作為定性定量分析工具，從混合感染是基因型轉(zhuǎn)換的前提，選擇壓力是基因型轉(zhuǎn)換的必要條件，不同基因型對(duì)藥物敏感性存在差異是基因型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因素這三個(gè)層面闡明了抗病毒治療中HBV基因型發(fā)生轉(zhuǎn)換的本質(zhì)，并結(jié)合臨床檢測指標(biāo)，探討基因型轉(zhuǎn)換與抗病毒藥物療效間的關(guān)系。本研究豐富了我們對(duì)HBV不同