超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記系統(tǒng)體內(nèi)示蹤內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)作用.pdf

1、血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等心血管疾病的始動(dòng)因素。其病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)膜下基質(zhì)暴露，血小板黏附聚集于該處，脫顆粒釋放出有絲分裂原，后者在趨化血小板和粒細(xì)胞聚集的同時(shí)，又刺激中膜平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、分泌以及血管壁結(jié)構(gòu)的重塑。同時(shí)，血管內(nèi)皮完整性的破壞也會(huì)導(dǎo)致其自身分泌的血管保護(hù)性介質(zhì)(一氧化氮、前列環(huán)素等)的減少，血管收縮性介質(zhì)及促生長(zhǎng)物質(zhì)的分泌增多。研究表明血管損傷后早期管腔內(nèi)的再上皮化速度是決定修復(fù)后局部?jī)?nèi)膜

2、增生程度的重要因素。如何加快損傷血管腔內(nèi)面的上皮化從而有效修復(fù)內(nèi)皮并抑制平滑肌增生已成為研究熱點(diǎn)之一。
　　內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類來(lái)源于骨髓，動(dòng)員后可進(jìn)入外周血循環(huán)，定向歸巢至損傷部位并進(jìn)行分化的祖細(xì)胞群。大量研究己表明內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生和內(nèi)膜修復(fù)中的重要作用。但在體外如何獲取足量的內(nèi)皮祖細(xì)胞，同時(shí)保證細(xì)胞的活性及生物學(xué)特征，避免其出現(xiàn)分化異常等仍是學(xué)者們需要解決的問(wèn)題。另外了解內(nèi)皮祖細(xì)胞體內(nèi)的生物學(xué)分布、分化增殖等細(xì)胞的定位反饋情況

3、可優(yōu)化移植細(xì)胞的途徑和細(xì)胞移植治療的時(shí)間，從而指導(dǎo)臨床的進(jìn)一步治療。
　　磁共振成像(MRI)具有特異性和敏感性高，空間分辨力強(qiáng)及臨床安全等優(yōu)勢(shì)得以迅速發(fā)展，同時(shí)磁性物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞后并不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著的生物學(xué)影響，且不需要放射性同位素(利于縱向長(zhǎng)期研究)，因而廣泛用于體內(nèi)示蹤干細(xì)胞的影像學(xué)檢查。本研究利用磁性物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞，從而體外示蹤移植細(xì)胞的生物學(xué)分布。首先我們體外分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，并在一定的條件下誘導(dǎo)其分化成為內(nèi)皮祖細(xì)胞

4、并擴(kuò)增，隨后通過(guò)超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記細(xì)胞，并將標(biāo)記后的細(xì)胞移植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈頸動(dòng)脈損傷模型，從而動(dòng)態(tài)示蹤細(xì)胞并評(píng)估內(nèi)皮祖細(xì)胞在內(nèi)皮修復(fù)過(guò)程中的作用。
　　第一部分骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定及擴(kuò)增兔骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的內(nèi)皮祖細(xì)胞。方法：密度梯度離心法結(jié)合貼壁法從骨髓中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。以VEGF、bFGF定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞。對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行

5、流式細(xì)胞、免疫熒光及免疫組織化學(xué)鑒定。結(jié)果：誘導(dǎo)后24h圓形細(xì)胞貼壁；72h細(xì)胞集落形成，呈紡錘形放射狀生長(zhǎng)：5d細(xì)胞呈漩渦狀或條索狀生長(zhǎng)；7d內(nèi)皮樣細(xì)胞成片生長(zhǎng)，互相連接并具有管腔樣結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示CD34、CD133雙陽(yáng)細(xì)胞占2.16±0.09％；免疫組化提示KDR陽(yáng)性細(xì)胞占72.5±8.76％。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示細(xì)胞Dil-ac-LDI，和FITC-UEA-1呈雙染陽(yáng)性。結(jié)論：密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離出的骨髓間

6、充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)體外誘導(dǎo)分化可培養(yǎng)成為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　第二部分體外超順磁性氧化鐵納米顆粒及綠色熒光蛋白病毒顆粒標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)研究
　　目的：評(píng)估超順磁性納米鐵顆粒及綠色熒光蛋白慢病毒顆粒標(biāo)記對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的毒性及細(xì)胞活力影響。方法：分別采用不同濃度的納米鐵顆粒轉(zhuǎn)染和不同感染復(fù)數(shù)的慢病毒顆粒感染內(nèi)皮祖細(xì)胞，評(píng)估細(xì)胞的MRI信號(hào)強(qiáng)度及細(xì)胞的活力試驗(yàn)、增殖試驗(yàn)、LDH釋放試驗(yàn)、遷移試驗(yàn)及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡試驗(yàn)。結(jié)果：隨著納米

7、鐵濃度的增加，T2WI MRI信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低，在50ug/ml和100ug/ml難以分辨；細(xì)胞活力試驗(yàn)提示隨著鐵濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸減低；LDH釋放率逐漸增加，但<10％；對(duì)增殖能力、遷移能力及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡均無(wú)影響。隨著感染復(fù)數(shù)(MOI)的增加，細(xì)胞活力明顯下降，MOI=50，細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MOI=50，LDH釋放率為10.34％，對(duì)細(xì)胞有一定毒性；MOI=25和50，細(xì)胞凋亡增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、(P<0.05)，且遷移能力受到影響(P<0.05);不同MOI對(duì)增殖能力影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：Fe2+濃度在25ug/ml，MOI=10的條件下，超順磁性氧化鐵顆粒對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性沒(méi)有影響，可以作為磁標(biāo)記。
　　第三部分體內(nèi)磁共振成像示蹤超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)內(nèi)膜損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：評(píng)價(jià)MRI示蹤SPIO標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植促損傷動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)的作用。方法：將菲立磁和綠色熒光蛋白雙標(biāo)記