鈣網(wǎng)蛋白通過Calcium-JNK-p53通路調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶-2--9的活性.pdf

1、背景：
　　鈣網(wǎng)蛋白是一種廣泛表達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結合蛋白和分子伴侶。靶向敲除鈣網(wǎng)蛋白基因會導致小鼠心室肌壁厚度的顯著變薄，以及小鼠出現(xiàn)臍疝，上述缺陷可能是由于細胞外基質(zhì)組成的改變引起的。鈣離子作為一個廣泛存在的信號分子，在細胞內(nèi)起著非常重要的作用：影響各種生理病理過程，激活酶原以及各種激素第二信使的激活等等。
　　細胞外基質(zhì)是一種重要的組織結構，為組織細胞的生長，發(fā)展，形態(tài)發(fā)生提供一個支持環(huán)境。金屬基質(zhì)蛋白酶作為一個鋅結合肽鏈內(nèi)

2、切酶超家族，可以降解細胞外基質(zhì)，其活性可以從以下幾方面調(diào)節(jié)：轉(zhuǎn)錄、分泌、酶原的激活，同時也在相應的特異性抑制劑下嚴格控制酶的活性。他們在很多生理病理過程中起著很重要的作用，可以導致一系列心血管疾病：血管重塑、動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定、心力衰竭、室壁瘤的發(fā)生、心肌梗死以及心肌梗死后左心室的重塑。
　　JNK是MAPK家族中的一員，在炎癥因子、環(huán)境壓力、凋亡誘導劑的刺激下起著重要的作用。P53作為細胞轉(zhuǎn)錄因子，在各種細胞周期運行和誘導凋亡中

3、起著重要作用。之前有研究表明靶向敲除鈣網(wǎng)蛋白基因會明顯影響p53的表達、功能、核定位能力，將導致鈣網(wǎng)蛋白細胞（crt-/-）受紫外線刺激后p53介導的凋亡率下降。而本課題組前期研究則提示鈣網(wǎng)蛋白缺失細胞，JNK信號通路受到影響：crt-/-細胞JNK2表達幾乎檢測不到。鑒于JNK和p53信號通路都是自然界中重要的調(diào)節(jié)通路，兩者之間的關系隨著細胞種類，外界環(huán)境等的變化而具有不同的相互調(diào)節(jié)方式。然而到目前為止，在小鼠胚胎成纖維細胞（Mous

4、e embryonic fibroblastcells，MEF)中JNK和p53的關系尚不明確。因此明確p53與JNK之間的關系有利于進一步為闡明心室重構的病理過程提供新的理論依據(jù)，并為臨床疾病的治療提供新方向。
　　本課題組前期實驗表明鈣網(wǎng)蛋白基因敲除后，金屬基質(zhì)蛋白酶-2表達及活性升高，而金屬基質(zhì)蛋白酶-9表達及活性降低，這種活性改變可能參與了鈣網(wǎng)蛋白敲除小鼠心臟的病理改變。其中JNK途徑參與了其中的改變，然而，目前為止尚未見

5、關于鈣網(wǎng)蛋白是如何通過JNK途徑調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶的活性的研究，因此，本實驗進一步探討鈣網(wǎng)蛋白通過哪些途徑參與金屬基質(zhì)蛋白酶活性的調(diào)節(jié)。
　　目的：
　　體外培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblastcells, MEF)野生株（widetype, wt）和鈣網(wǎng)蛋白基因敲除株（calreticulinnull,crt?/?），探討在兩者蛋白水平表達差異，研究兩者JNK和p53的關系，并初步探

6、討調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶-9和-2活性可能的信號通路。
　　方法：
　　1. Western-blot檢測鈣網(wǎng)蛋白表達情況，驗證細胞模型是否成立；利用雙向電泳檢測野生型和敲除型細胞蛋白表達差異點；
　　2.體外培養(yǎng)wt和crt-/-小鼠胚胎成纖維細胞，提取總蛋白利用免疫沉淀-western immunoblotting-化學發(fā)光法檢測兩株細胞間JNK活性的差異；
　　3. wt和crt-/-加入不同濃度的JNK特異性

7、抑制劑SP600125處理24小時后檢測p53的蛋白表達；同時wt和crt-/-加入不同濃度的p53抑制劑PFT-a處理24小時后檢測JNK2蛋白表達情況；
　　4. wt和crt-/-加入不同濃度的鈣離子熬合劑EGTA和增加細胞外鈣離子CaCl2后檢測MAPK家族和p53變化情況；
　　5. wt及crt-/-加入不同濃度鈣離子熬合劑EGTA和人為增加細胞外鈣離子CaCl2處理不同時間，明膠酶譜法檢測MMP-9和MMP-2

8、活性。wt及crt-/-加入不同濃度的JNK抑制劑SP600125(0，10，20 uM處理不同時間，明膠酶譜法檢測MMP-9和MMP-2活性；并用不同濃度p53激動劑Nutlin-3(0，5，10，20 uM)作用wt細胞及crt-/-細胞不同時間，明膠酶譜法檢測MMP-9和MMP-2活性。
　　結果：
　　1.鈣網(wǎng)蛋白在野生型細胞中有表達，在基因敲除型細胞中幾乎檢測不到，雙向電泳初步分離出部分蛋白表達差異點；
　　

9、2. EGTA熬合細胞外鈣離子可以抑制ERK1/2，JNK和p53的蛋白表達；
　　3. wt及 crt-/-加入不同濃度的JNK特異性抑制劑SP600125后，p53表達呈濃度依賴性降低；野生型和敲除型細胞加入不同濃度的p53抑制劑PFT-a后，JNK2表達呈濃度依賴性降低；
　　4.與crt-/-相比，wt細胞JNK活性更高；
　　5.熬合細胞外鈣離子可以使crt-/-細胞MMP-9和MMP-2活性呈濃度依賴性升高

10、，增加細胞外鈣離子可以使crt-/-細胞MMP-9和MMP-2活性呈濃度依賴性降低，而wt細胞則沒有明顯改變；wt細胞和crt-/-細胞加入SP600125后MMP-9活性呈濃度依賴性和時間依賴性升高，MMP-2活性在wt細胞中呈濃度依賴性升高，但在10uM SP600125時則呈時間依賴性降低，MMP-2活性在 crt-/-細胞中呈濃度依賴性降低，在10uM SP600125時呈時間依賴性升高；crt-/-細胞經(jīng)p53激動劑處理后，M