新型Eg5靶向抑制劑S-(methoxytrity1)-L-cysteine治療前列腺癌的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 前列腺癌(prostate cancer)是世界范圍內(nèi)男性的第二大惡性腫瘤，2008年全世界大約有903，500例新發(fā)前列腺癌病人。在歐美等西方國家，前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，同時也是致死性第二位的惡性腫瘤，2009年美國大約有27，360人死于去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）。亞洲國家前列腺癌的發(fā)病率和死亡率低于西方國家，但近年來隨

2、著生活習(xí)慣的改變及人口老齡化增加，前列腺癌在中國等亞洲國家呈現(xiàn)快速增長的趨勢。目前我國前列腺癌的發(fā)病率僅低于膀胱癌和腎癌，已居泌尿系惡性腫瘤的第三位，并且發(fā)病年齡也日趨年輕化，前列腺癌已經(jīng)成為臨床上老年男性常見惡性腫瘤之一。
　　 自從1941年，Huggins創(chuàng)立了雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)，現(xiàn)在包括手術(shù)去勢和LHRH類似物的藥物去勢為主的雄激素剝奪療法，已成為對于外科手

3、術(shù)或放射治療不能奏效的進展期前列腺癌病人的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。一般來說，這些病人最初1-2年內(nèi)對雄激素剝奪療法有效，但是隨后絕大部分進展為CRPC。2004年，發(fā)表在新英格蘭雜志的SWOG9916和TAX327兩項研究證實了以多西紫杉醇(docetaxel)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在治療CRPC中的重要作用?；谝陨蟽身椦芯康某晒?，F(xiàn)DA批準(zhǔn)以多西紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療為CRPC的一線治療，這一方案現(xiàn)已成為臨床上CRPC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。
　　

4、 但是，當(dāng)CRPC患者病情繼續(xù)進展，臨床上尚無有效的標(biāo)準(zhǔn)治療方案或者處理共識。并且多西紫杉醇等抗微管類的藥物，由于同時作用于有絲分裂期和間期的微管，抗癌的選擇性較差，會對神經(jīng)細胞造成損害而出現(xiàn)神經(jīng)病變等神經(jīng)毒性副作用，容易引起β-微管蛋白上藥物結(jié)合位點的變異及P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和β-微管蛋白的過表達而產(chǎn)生相應(yīng)的副作用，并能引起多重耐藥性(multidrug resistance，MDR);這些都限制了抗

5、微管藥物的臨床療效和應(yīng)用。多西紫杉醇耐藥性CRPC患者平均生存期通常低于1年。因此，急切需要我們發(fā)展新的替代治療策略，以延長患者的生存期和提高患者的生存質(zhì)量。
　　 腫瘤細胞進入細胞周期后，其有絲分裂不受調(diào)控，導(dǎo)致不斷的生長增殖?，F(xiàn)在臨床廣泛應(yīng)用的多西紫杉醇等抗微管類細胞毒性藥物正是對細胞有絲分裂進行干擾從而抑制腫瘤細胞的增殖。Eg5，又被稱作紡錘體驅(qū)動蛋白，在細胞有絲分裂早期對雙極紡錘體的形成和復(fù)制染色體的分離起著至關(guān)重要的作

6、用，表達于增殖的組織細胞中，已成為一個極具吸引力腫瘤化療靶點。
　　 研究表明，Eg5蛋白高表達于惡性增殖的組織細胞中，但在穩(wěn)定成熟分化的組織細胞如機體的神經(jīng)細胞中未見其表達。研究證實，Eg5蛋白作為新的抗有絲分裂藥物的靶點進行腫瘤化療時，對機體正常組織無影響，臨床應(yīng)用副作用少，無抗微管藥物類似的神經(jīng)毒性副作用。
　　 1999年Science報道了第一個小分子Eg5蛋白抑制劑monastrol，由于其能誘導(dǎo)單星樣紡錘體

7、（monoastral spindle）的形成而得名，該藥能特異性的結(jié)合Eg5蛋白并抑制其功能，誘導(dǎo)增殖的腫瘤細胞停滯在有絲分裂期，并促使細胞凋亡。Eg5蛋白抑制劑不作用于微管，不能被P-糖蛋白轉(zhuǎn)移到細胞外，可克服由于P-糖蛋白過表達而引起的多重耐藥性，故對紫杉烷類耐藥的腫瘤也能起到有效的治療效果。鑒于monastrol的有效的抗腫瘤細胞增殖作用，大量小分子Eg5抑制劑被相繼研究開發(fā)出來。
　　 STLC(S-trityl-L-

8、cystein)是DimitriosA等于2004年首先發(fā)現(xiàn)證實的有效的小分子Eg5蛋白抑制劑，與monastrol具有相同Eg5結(jié)合位點，與Eg5結(jié)合更加緊密、特異性更高，抗細胞增殖的能力比monastrol提高了約36倍。日本京都大學(xué)對STLC進行化學(xué)修飾后，首先發(fā)現(xiàn)報道了S(MeO)TLC(S-(methoxytrityl)-L-cysteine)，一種強有力的細胞滲透性小分子Eg5蛋白抑制劑，在測試的STLC衍生物中抗細胞增殖的

9、能力最強。S(MeO)TLC能特異性的與Eg5蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)單極紡錘體的形成，其抑制細胞增殖的能力比STLC提高了10倍。最近京都大學(xué)藥學(xué)部又研制了KPYC10665(2-(trifluoromethyl)-9H-carbazole),KPYC10666(2-(tert-butyl)-9H-carbazole）和KPYC10728(7-(trifluoromethyl)-9H-pyrido[3，4-b]indole)等多種聯(lián)芳類有效的E

10、g5抑制劑。
　　 我們的前期研究已經(jīng)報道了S(MeO)TLC作為新型的Eg5蛋白靶向抑制劑，在膀胱癌、腎癌中表現(xiàn)出強有力的抗癌效能，并且相比以往報道的大量Eg5抑制劑，有效給藥濃度更低、療效更好、安全性和靶向特異性更高。目前尚沒有研究系統(tǒng)的探討臨床前列腺癌標(biāo)本及前列腺癌細胞株中Eg5蛋白的表達，也沒有關(guān)于Eg5抑制劑特別是S(MeO)TLC對前列癌的體內(nèi)外治療效果及機制的系統(tǒng)研究。所以，我們設(shè)計了本實驗，從而為前列癌的臨床診斷

11、及靶向治療提供有效的新型方法。
　　 目的：
　　 檢測前列腺癌臨床標(biāo)本及前列腺癌細胞中Eg5蛋白的表達水平，以探討Eg5蛋白是否可以作為前列腺癌治療的有效靶點，并探討S(MeO)TLC這種新型的Eg5抑制劑對前列腺癌的體內(nèi)外抗癌效能及機制。
　　 方法：
　　 (1)分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測由80例臨床局限性前列腺癌標(biāo)本構(gòu)建的組織芯片(tissuemicroarray，TMA)和用Wester

12、nBlot免疫蛋白印跡方法檢測人前列腺癌細胞株P(guān)C3，DU145和LNCaP中Eg5的表達，分析探討Eg5蛋白是否可以作為前列腺癌治療的有效靶點。
　　 (2)體外實驗:采用MTT和臺盼藍染色細胞活性實驗法檢測KPYC10665、KPYC10666、KPYC10728、STLC和S(MeO)TLC這5種Eg5抑制劑對前列腺癌細胞的抗增殖作用，計算出藥物的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitingconcentration，IC50

13、);并通過Hoechst細胞核染色細胞凋亡檢測法，流式細胞儀細胞周期分布檢測法和免疫熒光法進一步探討S(MeO)TLC抗前列腺癌細胞的增殖并誘導(dǎo)前列腺癌細胞體外凋亡的效果和機制;最后采用蛋白免疫印跡方法檢測S(MeO)TLC誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡中Caspase途徑相關(guān)蛋白表達，探討S(MeO)TLC誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡的分子通路機制。
　　 (3)體內(nèi)試驗:構(gòu)建穩(wěn)定表達熒光素酶的前列腺癌細胞株P(guān)C3Luc，然后評估S(MeO)T

14、LC對PC3Luc皮下移植腫瘤模型的治療效果;并用H&E染色的方法檢測皮下種植腫瘤標(biāo)本的情況，進一步探討S(MeO)TLC體內(nèi)抑制腫瘤增殖的機制。
　　 結(jié)果：
　　 (1)PC3，DU145和LNCaP三種前列腺細胞中均檢測到了Eg5表達。超過一半(44/80)的臨床前列腺癌標(biāo)本中也檢測到了Eg5表達，并且前列腺臨床標(biāo)本中Eg5表達與Ki67標(biāo)記指數(shù)(ki67labelingindex)成顯著相關(guān)(P=0.004)。<

15、br>　　 (2)體外實驗結(jié)果表明S(MeO)TLC比其他4個測試的Eg5抑制劑表現(xiàn)出更強的抗前列腺細胞增殖作用，通過誘導(dǎo)增殖細胞停滯在有絲分裂期并形成典型的單極紡錘體細胞，隨后同時激活內(nèi)源性和外源性Caspase依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)前列腺癌細胞發(fā)生凋亡。
　　 (3)體內(nèi)實驗表明S(MeO)TLC對前列腺細胞皮下移植瘤模型顯著的抑制作用(P＜0.05)也是通過誘導(dǎo)細停滯在有絲分裂期而實現(xiàn)的。
　　 結(jié)論：
　　

16、 (1)臨床前列腺癌標(biāo)本和前列腺癌細胞均存在Eg5蛋白的表達，Eg5蛋白可作為新型靶向化療藥物的有效的治療靶點。
　　 (2)體內(nèi)實驗及皮下種植腫瘤實驗均證實S(MeO)TLC作為新型Eg5蛋白靶向小分子抑制劑通過將前列腺癌細胞及異種種植腫瘤細胞有絲分裂期停滯而抑制腫瘤細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞同時經(jīng)內(nèi)源性和外源性caspase依賴性途徑發(fā)生凋亡。
　　 (3)S(MeO)TLC可通過腹腔注射的方式給藥，且是安全可靠的，并且其

17、抑制體內(nèi)外前列腺腫瘤生長的效果要顯著強于STLC等其他Eg5抑制劑。
　　 (4)S(MeO)TLC是一種對前列腺癌有效的、有前途的抗癌藥物。
　　 創(chuàng)新及意義：
　　 (1)國內(nèi)外首次分析了局限性前列腺癌臨床標(biāo)本中Eg5蛋白表達水平，為前列腺癌臨床診斷提供依據(jù)。
　　 (2)國內(nèi)外首次證實了Eg5蛋白可以作為前列腺癌治療新的有效靶點。
　　 (3)國內(nèi)外首次對新型Eg5抑制劑S(MeO)TLC治