p73轉(zhuǎn)錄水平在苯并(a)芘致MRC-5和H1299細(xì)胞死亡中的作用.pdf

1、多環(huán)芳烴類(lèi)化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)在環(huán)境中分布廣泛。其中苯并(a)芘(benzo[a]pyrene，BaP)是PAHs中最具代表性的環(huán)境致癌物。它主要來(lái)源于交通運(yùn)輸、工業(yè)生產(chǎn)以及生活環(huán)境中有機(jī)物的熱分解與不完全燃燒。
　　 流行病學(xué)研究表明：BaP的暴露與人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如肺癌和皮膚癌。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)BaP 可阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與DNA形成加合物，導(dǎo)

2、致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡。
　　 細(xì)胞死亡包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死兩種形式。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自發(fā)的、程序性的死亡過(guò)程。壞死則是因病理而產(chǎn)生的被動(dòng)死亡。當(dāng)調(diào)控細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子受抑制時(shí)，細(xì)胞的死亡形式則可能由凋亡轉(zhuǎn)為壞死。研究證據(jù)顯示：抑癌基因p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路參與BaP 致細(xì)胞增值和凋亡中的調(diào)控。但是，p73在BaP 致細(xì)胞死亡中的調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。
　　 P73是p53的重要家族成員成員之一。它在結(jié)構(gòu)和功能上與

3、p53 有相似性。P73可激活p53下游調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡的靶基因，從而參與BaP 致細(xì)胞DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)。然而，p73與p53在功能與激活機(jī)制上也有差異性。P73 能否獨(dú)立于p53而介導(dǎo)BaP 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死尚無(wú)確切報(bào)道。
　　 基于此，本研究以人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)和p53 缺失的人肺腺癌細(xì)胞(H1299)為靶細(xì)胞，設(shè)定BaP 染毒組(8 μM、16 μM、32 μM、64 μM和128 μM）、溶劑對(duì)照組

4、(S9+DMSO+含％5血清培養(yǎng)基(S9 終濃度為3‰ DMSO 終濃度<1‰)和空白對(duì)照組處理細(xì)胞24 h。用MTT 實(shí)驗(yàn)和單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)分別評(píng)價(jià)細(xì)胞的活力和靶細(xì)胞DNA的損傷程度。同時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)BaP 對(duì)靶細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯和死亡的影響。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)p73 主要上游基因及其下游細(xì)胞死亡和周期阻滯相關(guān)基因的mRNA 水平，可望為進(jìn)一步研究篇p53 非依賴(lài)性信號(hào)通路在BaP 致細(xì)胞死亡中的調(diào)控作用提供科學(xué)線索。

5、本研究主要結(jié)果如下：
　　 1.細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)用設(shè)定濃度的BaP 染毒(8 μM、16 μM、32 μM、64 μM和128 μM）處理MRC-5和 H1299細(xì)胞24 h 時(shí)。在MRC-5細(xì)胞，與溶劑對(duì)照組相比，除8 μM BaP 染毒組外，其它BaP 處理組細(xì)胞的存活率均顯著下降(P<0.05)；128 μM BaP 染毒組的細(xì)胞存活率降低了30％。在H1299細(xì)胞，所有BaP 染毒組的細(xì)胞存活率均顯著性降低(P<0.05)，

6、并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。相對(duì)溶劑對(duì)照相細(xì)胞而言，32 μM BaP 染毒組細(xì)胞的存活率降低了40％。
　　 2.單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)用設(shè)定濃度的BaP分別染毒MRC-5細(xì)胞和H1299細(xì)胞24 h。在MRC-5細(xì)胞，與溶劑對(duì)照組相比，各BaP 處理組細(xì)胞的DNA損傷程度均顯著增加(P<0.01)，峰值在在64 μM BaP 染毒組。在H1299細(xì)胞，BaP 致DNA損傷程度是隨著染毒濃度的增加而顯著增加(P<0.01)，有劑量-效應(yīng)依

7、賴(lài)關(guān)系。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)用設(shè)定濃度的BaP分別染毒MRC-5細(xì)胞和H1299細(xì)胞24 h，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各時(shí)相細(xì)胞數(shù)。在MRC-5細(xì)胞，與溶劑對(duì)照組相比，BaP 主要引起G1 期細(xì)胞阻滯。
　　 所有染毒組的凋亡細(xì)胞數(shù)量與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。但是，所有染毒組的壞死細(xì)胞數(shù)量百分比與溶劑對(duì)照組相比均顯著性增加(P<0.05)。在H1299細(xì)胞，BaP 引起的細(xì)胞周期阻滯則主要在G2 期。

8、所有BaP 染毒組的壞死細(xì)胞數(shù)量百分比與溶劑對(duì)照組相比均顯著性增加(P<0.05)；相對(duì)MRC-5細(xì)胞的各染毒組均顯著性升高(P<0.05)。但是，凋亡細(xì)胞數(shù)僅在128 μM BaP 染毒組有顯著性增加(P<0.05)。
　　 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)用設(shè)定濃度的BaP 染毒MRC-5細(xì)胞24 h，除16 μM BaP 染毒組外，其它染毒組ATM基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。E2F1和Bcl-2基因mRNA

9、僅在16 μM和128 μM BaP 染毒組有顯著性表達(dá)(P<0.05)。除16 μM和128 μM BaP染毒組外，其它染毒組的Puma基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。所有染毒組p53，p73和p21基因的mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。但是，在所有BaP 染毒組并未檢出14-3-3 σ，ATR，Bax，Noxa和caspase3基因mRNA的顯著性表達(dá)(P>0.05)。
　　 用設(shè)定濃度的BaP

10、染毒H1299細(xì)胞24 h，除32 μM和64 μM BaP 染毒組外，其它染毒組ATM和ATR基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。E2F1，p73和Puma基因mRNA在所有BaP 染毒組均有顯著性表達(dá)(P<0.05)。除64 μM BaP染毒組外，其它染毒組Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。但是，在所有BaP 染毒組均未檢出Gadd45，Bax，Noxa和caspase3基因mRNA的顯著性表達(dá)(