改建型STAT1基因?qū)NF-β干預(yù)H1299細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:探討改建型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）對(duì)人重組干擾素-β(IFN-β)干預(yù)非小細(xì)胞肺癌增殖及凋亡的影響，為改建型STAT1治療非小細(xì)胞肺癌提供基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.慢病毒載體的擴(kuò)增制備:將保存在溫州醫(yī)學(xué)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室的慢病毒載體Lenti-EGFP（含EGFP的對(duì)照質(zhì)粒）、Lenti-STAT1（含野生型STAT1基因）及Lenti-STAT1-CC（含改建型STAT1基因）轉(zhuǎn)至大腸桿菌E.

2、coli DH5α內(nèi)，再根據(jù)質(zhì)粒大量抽提試劑盒說明書抽提3種慢病毒載體，通過293T人胚腎細(xì)胞做為媒介，用氯化鈣方法包裝收集Lenti-EGFP、Lenti-STAT1及Lenti-STAT1-CC慢病毒載體。
　　 2.H1299細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、分組及鑒定:將Lenti-EGFP、Lenti-STAT1及Lenti-STAT1-CC慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。根據(jù)有無轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染的不同慢病毒載體，將細(xì)胞分為H1299空白組、L

3、enti-EGFP對(duì)照組、Lenti-STAT1組及Lenti-STAT1-CC組4組細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察4組細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況，用Western blot檢測(cè)4組細(xì)胞所表達(dá)的STAT1蛋白。
　　 3.IFN-β對(duì)各組H1299細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的影響:用不同濃度（分別為0U/L，10U/L，100U/L，1000U/L，2000U/L）的IFN-β干預(yù)4組細(xì)胞72h，提取細(xì)胞蛋白，

4、Bradford法測(cè)定蛋白濃度，Western blot檢測(cè)4組細(xì)胞所表達(dá)的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASPASE3)。
　　 4.IFN-β對(duì)各組H1299細(xì)胞增殖活性的影響:用不同濃度(分別為0U/L，10U/L，100U/L，1000U/L，2000U/L)的人重組干擾素-β干預(yù)4組細(xì)胞72h后用甲基噻唑基四唑法(MTT)測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，再計(jì)算其生長(zhǎng)抑制率。
　　 結(jié)果:

5、　　 1.將慢病毒載體轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察到Lenti-EGFP對(duì)照組、Lenti-STAT1組及Lent i-STAT1-CC組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)，證明已將慢病毒載體轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞內(nèi)。
　　 2.H1299空白組、Lenti-EGFP對(duì)照組細(xì)胞幾乎不表達(dá)STAT1蛋白，而Lenti-STAT1組及Lenti-STAT1-CC組細(xì)胞有STAT1蛋白的表達(dá)。
　　 3.不同濃度I

6、FN-β干預(yù)4組H1299細(xì)胞(H1299空白組，Lenti-EGFP對(duì)照組，Lenti-STAT1組，Lenti-STAT1-CC組)72h，有如下結(jié)果:(1)在相同濃度IFN-β干預(yù)下，Lenti-EGFP對(duì)照組與H1299空白組細(xì)胞表達(dá)的PCNA蛋白量無差異。(2)在無IFN-β干預(yù)下，各組H1299細(xì)胞表達(dá)的PCNA蛋白量無明顯差異。(3)相同濃度IFN-β干預(yù)下，Lenti-STAT1-CC組細(xì)胞表達(dá)PCNA蛋白量比H1299

7、空白組，Lenti-EGFP對(duì)照組，Lenti-STAT1組明顯減少，并且Lenti-STAT1-CC組細(xì)胞表達(dá)PCNA蛋白量隨IFN-β濃度增加而減少。(4)在相同濃度IFN-β干預(yù)下，Lenti-STAT1-CC組細(xì)胞表達(dá)的PCNA蛋白量的下降率明顯高于H1299空白組，Lenti-EGFP對(duì)照組，Lenti-STAT1組。(5)有IFN-β干預(yù)的Lenti-STAT1-CC組細(xì)胞表達(dá)的PCNA蛋白量明顯低于無IFN-β干預(yù)的Len

8、ti-STAT1-CC組細(xì)胞。
　　 4.用IFN-β干預(yù)4組H1299細(xì)胞（H1299空白組，Lenti-EGFP對(duì)照組，Lenti-STAT1組，Lenti-STAT1-CC組）72h，發(fā)現(xiàn)在相同濃度IFN-β干預(yù)下，H1299空白組，Lenti-EGFP對(duì)照組，Lenti-STAT1組，Lenti-STAT1-CC組細(xì)胞表達(dá)的CASPASE3蛋白量均無明顯差異。
　　 5.不同濃度的IFN-β干預(yù)4組H1299細(xì)胞

9、（H1299空白組，Lenti-EGFP對(duì)照組，Lenti-STAT1組，Lenti-STAT1-CC組）72h后，Lenti-STAT1-CC組生長(zhǎng)抑制率明顯高于H1299空白組，Lenti-EGFP對(duì)照組，Lenti-STAT1組的生長(zhǎng)抑制率(P＜0.05)，并隨IFN-β濃度增加而生長(zhǎng)抑制率增高。
　　 結(jié)論:改建型STAT1(STAT1-CC)基因可以增強(qiáng)IFN-β對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞增殖的抑制作用，但是STAT