應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默STAT1基因?qū)ο∈驣NF-γ、IL-5、ICAM-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:STAT1參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和生長因子的細(xì)胞反應(yīng),是連接各種膜受體和效應(yīng)器之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。它主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值、分化、凋亡。在哮喘的發(fā)病中JAK/STAT信號通路也起著重要的作用。有研究表明,機(jī)體STAT1的表達(dá)水平對免疫的調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)起著決定性的作用。因此目前在呼吸系統(tǒng)的疾病中對JAK/STAT信號通路的研究同樣集中在哮喘上。正因?yàn)镴AK/STAT信號通路存在細(xì)胞因子特異性,因此阻斷某種JAK/STAT通路就可以阻斷其

2、相對應(yīng)的細(xì)胞因子的作用。RNA干擾是一種強(qiáng)有效的抑制基因功能的工具。它能夠促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的降解,進(jìn)而阻止mRNA翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)沉默轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子1(signal transducer and activator of transcription1 STAT1)基因,探討其對支氣管哮喘小鼠STAT1蛋白與INF-γ、IL-5、ICAM-1的表達(dá)的

3、影響。使基因治療成為可能導(dǎo)致治療或者甚至預(yù)防性治療支氣管哮喘等氣道慢性炎癥性疾病的新方法。
　　方法:32只4周齡BALB/C雌鼠隨機(jī)分為4組;分別為正常組、PBS組、空質(zhì)粒組(隨機(jī)片段RNAi)和siRNA組(pG-2)。PBS組、空質(zhì)粒組和siRNA組分別用新鮮配制的OVA/Al(OH)3混懸液(100ugOVA+1mgAl(OH)3干粉加入1mlPBS液配制而成),分別于第1天和第14天腹腔注射OVA/Al(OH)3混懸液,

4、使BABL/C小鼠致敏;而正常組用1mL的生理鹽水腹腔注射。在第26-29天siRNA組濃縮的siRNA40ul(100ug)滴鼻;PBS組用40ulPBS液滴鼻;空質(zhì)粒組用隨機(jī)片段RNAi40ul滴鼻。正常組用生理鹽水滴鼻。在第28-30天正常組用生理鹽水滴鼻,PBS組、空質(zhì)粒組及siRNA組用OVA溶液50ul(50ug)滴鼻激發(fā)哮喘,在末次滴鼻后12小時(shí)引頸處死小鼠。通過單肺灌洗留取肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)。取

5、BALF上清液,應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA),檢測其中的γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素5(IL-5)、細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)的表達(dá)水平。肺組織切片做免疫組織化學(xué)染色及HE染色。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析,多個(gè)樣本均數(shù)之間的多重比較用LSD法,以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)分析BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)與IFN-γ,IL-5,ICAM-1間相關(guān)性。
　　結(jié)果:(

6、1)正常組小鼠肺組織切片HE染色可見;支氣管內(nèi)壁光滑,肺泡間隔菲薄,肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出物。空質(zhì)粒組及siRNA組哮喘小鼠肺組織病理切片HE染色可觀察到:支氣管粘膜水腫,支氣管及血管周圍有大量的炎癥細(xì)胞的浸潤,以Eos為主;肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)也可見Eos的浸潤。細(xì)、小支氣管內(nèi)可見黏液栓。氣道上皮多處斷裂,基底膜明顯增厚且形態(tài)不規(guī)則。而siRNA組炎癥細(xì)胞的浸潤及黏液的分泌較空質(zhì)粒組與PBS組比較明顯減輕。(2)STAT1蛋白主要表達(dá)與小鼠

7、的氣道上皮細(xì)胞。(3)siRNA組STAT1蛋白表達(dá)水平明顯低于PBS組及空質(zhì)粒組,但高于正常組。IL-5、ICAM-1的表達(dá)水平亦呈類似改變,而IFN-γ則呈相反的改變。(4)正常組的肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù),嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)以及淋巴細(xì)胞(LC)數(shù)量較PBS組、空質(zhì)粒組及siRNA組減少。而siRNA組肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)就各種細(xì)胞數(shù)均較PBS組與空質(zhì)粒組減少,它們之間的差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:1.哮