HMME介導的光動力療法制備鼠肝癌細胞MM45T-Li疫苗的研究.pdf

1、光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)是一種治療惡性腫瘤和某些良性增生性疾病的新方法。光動力療法在對腫瘤細胞產(chǎn)生直接的殺傷作用同時，還可以增強宿主的抗腫瘤免疫反應。目前已有研究建立了光動力療法制備腫瘤疫苗的方法，但對于光動力療法制備肝癌疫苗的研究并不多見。本研究以鼠肝癌細胞MM45T-Li為研究模型，探討利用光動力療法制備肝癌疫苗的抗瘤效應，為肝癌的免疫治療提供一種新的途徑。
　　目的：
　　1.探討

2、光動力療法在體外對鼠肝癌細胞MM45T-Li的殺傷作用特點，以尋找光動力療法制備疫苗的作用參數(shù)。
　　2.分析光動力療法制備的腫瘤疫苗對小鼠肝癌移植瘤的體內(nèi)預防保護和治療作用，比較不同光照劑量對PDT制備細胞疫苗的影響。
　　3.探討光動力療法制備腫瘤細胞疫苗對小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫反應的影響。
　　方法：
　　1.利用熒光顯微鏡觀察不同濃度HMME在MM45T-Li細胞中的吸收；多功能酶標儀定量分析細胞內(nèi)HMME在

3、不同時間點的熒光強度；共聚焦顯微鏡觀察HMME在MM45T-Li細胞中的亞細胞定位；在以HMME為光敏劑，630nm激光為光源的PDT作用于細胞，MTT法檢測光動力療法對細胞的殺傷效應。Hoechst細胞核熒光染色法觀察光動力療法對細胞核形態(tài)的改變。AnnexinV-FITC/PI雙染結合流式細胞儀檢測光動力療法檢測光動力療法誘導的細胞凋亡。
　　2.在功率密度為1.5mw/cm2的條件下，利用不同能量密度的光動力療法作用細胞24

4、h后提取細胞裂解液作為腫瘤疫苗。以生理鹽水作為對照，反復凍融法制備的疫苗為陽性對照。疫苗免疫小鼠后建立小鼠肝癌模型，觀察腫瘤體積變化。腫瘤生長至第16天，處死小鼠，稱量腫瘤重量，HE染色觀察腫瘤病理組織學變化。
　　3.免疫接種結束后7d，流式細胞術檢測外周血T細胞亞群的變化。同時利用階梯密度離心法提取脾淋巴細胞，MTT法檢測體外淋巴細胞毒性。
　　4.檢測疫苗的治療作用：建立小鼠肝癌模型，疫苗免疫荷瘤小鼠，觀察腫瘤體積變化

5、。觀察周期為60天，計錄荷瘤小鼠生存期。
　　結果：
　　1.細胞內(nèi)HMME含量隨著光敏劑濃度及孵育時間的增加而增加。選擇4h孵育時間及濃度為20μg/ml的HMME作為PDT的最佳參數(shù)。共聚焦熒光顯微鏡顯示HMME分布在細胞核外，定位于線粒體。MTT檢測結果顯示PDT對細胞的殺傷率隨著光敏劑濃度和能量密度的增加而增加。當HMME濃度為20μg/ml，光照劑量為2.7 J/cm2時，PDT對細胞的殺傷率30.21％；光照劑量

6、為7.2J/cm2時，殺傷率達90.65％。Hoechst染色觀察PDT作用24h后部分細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、核固縮、核碎裂等形態(tài)學改變。AnnexinV/PI流式細胞術檢測結果顯示在能量密度為0.9至4.5J/cm2時，PDT誘導的細胞凋亡隨著能量密度的增加而增加，最到達30.5±4.2％；當能量密度增加至7.2J/cm2時，細胞以壞死為主，凋亡率下降為4.1±2.7％。
　　2.依據(jù)PDT的殺傷效果，選擇能量密度為2.7和7.2

7、J/cm2的光照劑量制備疫苗。在疫苗對荷瘤小鼠的預防保護實驗中，與對照組相比，2.7J/cm2PDT組疫苗的腫瘤生長緩慢，腫瘤的體積及重量明顯降低。對腫瘤體積的抑制率最高為59.8％。而大劑量7.2J/cm2PDT組中的腫瘤體積重量下降不明顯。各組腫瘤的病理組織表現(xiàn)無明顯差異。
　　3.與對照組比較，2.7J/cm2 PDT及7.2J/cm2PDT組疫苗可以明顯改善機體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)，逆轉外周血T細胞亞群CD4+/CD8+的比值

8、，增加NK細胞比例，同時增加脾淋巴細胞特異性細胞毒性。
　　4.在疫苗對荷瘤小鼠的治療實驗中，2.7J/cm2 PDT組疫苗的腫瘤生長緩慢，甚至消退，明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，并提高荷瘤小鼠生存率。
　　結論：
　　1.HMME介導的光動力療法可以有效殺傷鼠肝癌細胞MM45T-Li，誘導的細胞凋亡與光照劑量密切相關。
　　2.光動力療法制備的肝癌細胞疫苗明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，具有預防保護和治療作用。小劑量