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文檔簡介
1、研究背景與目的:
糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain,DNP)由于易引起自發(fā)痛、痛覺過敏甚至痛覺超敏等異常疼痛癥狀,對患者生活質(zhì)量帶來極大影響。目前,糖尿病導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機制尚不清楚,有不少學(xué)者認(rèn)為與中樞敏化有關(guān)。中樞敏化時,交感神經(jīng)節(jié)后纖維發(fā)生芽生現(xiàn)象,與背根神經(jīng)節(jié)形成“交感-感覺偶聯(lián)”,使得交感神經(jīng)末梢和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體之間形成直接和間接的類似于突觸的功能性結(jié)構(gòu)。有研究證實
2、糖尿病大鼠變性及再生的Aδ和C纖維及交感神經(jīng)芽枝上的α2腎上腺素能受體都具有高度的敏感性,當(dāng)交感神經(jīng)節(jié)后纖維興奮時,交感神經(jīng)末梢釋放出去甲腎上腺素并作用于α2腎上腺素能受體,激活背根神經(jīng)節(jié)傳入神經(jīng)元,使其產(chǎn)生敏感化和興奮的改變,從而引起痛覺過敏、痛覺超敏等癥狀。也有學(xué)者認(rèn)為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的出現(xiàn)與離子通道活性改變有關(guān)。當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生損傷時,背根神經(jīng)節(jié)和軸突細(xì)胞電壓門控 K+,Na+,Ca2+等離子通道的表達(dá)及功能也發(fā)生改變,可導(dǎo)致自
3、發(fā)性的異位神經(jīng)放電及痛性神經(jīng)病變,并且,大量研究表明神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生和維持的重要機制之一是神經(jīng)異位放電。
G蛋白偶聯(lián)內(nèi)向整流鉀通道(GIRK)是7個內(nèi)向整流鉀通道亞家族中的一員,由5個亞單元組成,其中GIRK1~4亞單元已經(jīng)在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),GIRK5亞單元也在爪蟾卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS),GIRK通道能與許多G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,如α2腎上腺素能受體、多巴胺能
4、受體、毒菌堿受體、γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)受體等相結(jié)合。生物體內(nèi),GIRK以同源及異源多聚體的形式存在,受G蛋白調(diào)節(jié),可直接與Gβγ結(jié)合并被激活,已證實可擴散的 GIRK蛋白的 GIRK1-4亞單位與Gβγ的N及 C末端直接結(jié)合。GIRK具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性,靜息電位,神經(jīng)遞質(zhì)釋放,起慢突觸后抑制的作用,其在疼痛的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。并且,內(nèi)啡肽等內(nèi)源性疼痛調(diào)節(jié)物質(zhì)和一些鎮(zhèn)痛藥物均能激
5、活GIRK通道,激活的GIRK通道抑制神經(jīng)元的沖動發(fā)放,發(fā)揮著減弱疼痛信號的傳導(dǎo)的作用。
右美托咪定是一種高效、高選擇性α2腎上腺素能受體激動藥??赏耆せ瞀?B-AR,部分激活α2A-AR和α2C-AR。與可樂定相比,右美托咪定與α2-AR、α1-AR結(jié)合的比例為1620:1,遠(yuǎn)高于可樂定的300:1。右美托咪定能激活α2A-AR產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制交感活性等作用。在一項治療大鼠急性痛和神經(jīng)病理性疼痛的研究中發(fā)現(xiàn),右美托咪定
6、對這兩種不同的疼痛均可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用,并隨劑量的增大而增強。
目前,單次鞘內(nèi)注射右美托咪定對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)GIRK1表達(dá)的影響仍未見報道。因而,本實驗擬建立糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型,采用單次鞘內(nèi)注射右美托咪啶的方法,觀察右美托咪啶對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠機械痛閾及背根神經(jīng)節(jié)GIRK1表達(dá)的影響,評價右美托咪定對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛所產(chǎn)生的抗傷害效應(yīng)及其可能存在的鎮(zhèn)痛機制,為開展臨床研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)
7、。
方法:
8-10周成年雄性SD大鼠100只,體重在200-220g之間,清潔級,由廣東省實驗動物中心提供。造模前兩天,測大鼠雙側(cè)后足基礎(chǔ)50%機械縮足閾值(50%MWT)。禁食12小時,于造模當(dāng)天測量大鼠體重,空腹血糖值。隨機選取大鼠60只單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg,2周后,選取血糖值大于300mg/dL,且雙側(cè)后足50%機械縮足閾值(50%MWT)小于4g者為DNP模型成功。余下大鼠40只
8、為對照組,按2.8ml/kg的劑量腹腔注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。從DNP大鼠中隨機選取39只,分為D-D組(n=24,DNP大鼠鞘內(nèi)注射右美托咪定1.5ug/Kg)、D-C組(n=15,DNP大鼠鞘內(nèi)注射等容量生理鹽水);從對照組大鼠中隨機選取39只,分為H-D組(n=24,大鼠鞘內(nèi)注射右旋美托咪定1.5ug/Kg)、H-C組(n=15,大鼠鞘內(nèi)注射容量的生理鹽水)。采用von frey細(xì)絲法測大鼠造模前、造模后14天機械痛閾,以及鞘
9、內(nèi)注射后0.5h、1h、2h、4h、6h、24h的機械痛閾。采用免疫熒光法測定大鼠背根神經(jīng)節(jié) GIRK1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞計數(shù),Western blot法檢測GIRK1蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.造模后大鼠生理和活動的改變四組大鼠基礎(chǔ)血糖值無明顯差異(P>0.05)。H-D組和H-C組大鼠接受腹腔注射后每日飲食尿量正常,性格溫順,第十四天毛色光滑柔軟,體重正常,血糖值較基礎(chǔ)血糖值無明顯變化(P>0.05);而D-D組和D
10、-C組大鼠則血糖值明顯升高(P<0.05),表現(xiàn)出明顯的糖尿病癥狀:毛發(fā)稀少,毛色暗淡,身形消瘦,體重減輕,每日飲食飲水及尿量均明顯增多,性格暴躁。H-D組和D-D組大鼠在鞘內(nèi)注射右旋美托咪啶后30min內(nèi)有輕微嗜睡現(xiàn)象,但可輕易喚醒,喚醒后活動無明顯障礙。
2.機械疼痛閾值的變化造模前四組大鼠基礎(chǔ)50%MWT差異無無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。D-D組與D-C組腹腔注射STZ14天后的50%MWT較基礎(chǔ)50%MWT均明顯降低
11、(P<0.05)。與H-D組及H-C組比較,D-D組與D-C組腹腔注射STZ14天后的50%MWT均明顯降低(P<0.05)。D-D組在鞘內(nèi)注射后0.5h、1h、2h、4h、6h各時間點50%MWT較D-C組明顯增高(P<0.05),但在24h時兩組50%MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。H-D組在鞘內(nèi)注射后0.5h、1h、2h、4h、6h各時間點50%MWT較 H-C組明顯增高(P<0.05),在24h時兩組50%MWT差異無統(tǒng)
12、計學(xué)意義(P>0.05)。在0.5h、1h、2h、4h、6h各時間點H-D組與D-D組50%MWT均較腹腔注射14天后的50%MWT明顯增高(P<0.05),但兩組在對應(yīng)時間點的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
3.脊髓背根神經(jīng)節(jié)GIRK1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞計數(shù)比較在DNP模型大鼠,D-D組在鞘內(nèi)注射后2h、4h、6h的GIRK1表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較D-C組明顯增加(P<0.05)。在緩沖劑對照組模型,H-D組在鞘內(nèi)注射后2h、4
13、h、6h的 GIRK1表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較H-C組明顯增加(P<0.05)。而且,在2h、4h、6h各時間點,D-D的GIRK1表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較H-D組均有升高(P<0.05)。
4.脊髓背根神經(jīng)節(jié)GIRK1蛋白表達(dá)水平比較以GAPDH的IOD值作為內(nèi)參對照值,對兩組條帶進行IOD值的大小進行比較。GAPDH的分子量為36KD,GIRK1的分子量為56KD。D-D組與H-D組均有GIRK1蛋白表達(dá)。與H-D組比較,D-D組在鞘內(nèi)注
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