IGF-1在糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神經(jīng)節(jié)的表達.pdf

1、目的：糖尿病性膀胱病是一種糖尿病并發(fā)的泌尿系統(tǒng)的疾病，主要由糖尿病的周圍神經(jīng)病變引起的膀胱功能障礙，與其病程、是否系統(tǒng)治療及神經(jīng)病變程度相關(guān)，而與性別、年齡無關(guān)。糖尿病膀胱神經(jīng)病變主要累及支配膀胱的副交感神經(jīng)(骶2、3、4)以及交感神經(jīng)(胸11、12及腰1、2)，引起排尿反射出現(xiàn)異常，膀胱收縮力減弱，導(dǎo)致尿潴留或尿淋漓不盡，甚至出現(xiàn)尿失禁?；颊哂邢赂姑浲?、尿頻、尿急、尿痛而無力排尿等癥狀。膀胱內(nèi)長期存在殘余尿液易引起泌尿系的感染，導(dǎo)致腎

2、功能出現(xiàn)損害，甚至發(fā)生腎功能衰竭。因此，糖尿病性膀胱病的早期診斷及治療是十分非常重要的，其機制研究越來越受人們關(guān)注。近年來，發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子-1在神經(jīng)元和肌肉中分布廣泛，其化學結(jié)構(gòu)與胰島素相似，和其相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮作用，促進神經(jīng)細胞和肌細胞的再生，抑制其凋亡，在神經(jīng)元的生長、分化和能量代謝以及神經(jīng)保護方面都起著重要的作用。本研究運用免疫組化的方法，檢測胰島素生長因子-1(IGF-1)在糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神經(jīng)節(jié)組織中的表達變化

3、，來探討IGF-1在糖尿病性膀胱病的發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　1.實驗的動物及分組：
　　所用的動物為河北醫(yī)科大學實驗動物中心的35只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體重為200-250g。隨機分為兩組，對照組為15只，糖尿病組20只；SD大鼠禁食12h以上(過夜)，糖尿病組大鼠按60mg/Kg腹腔注射STZ，對照組大鼠按60mg/kg腹腔注射枸櫞酸鈉緩沖液；72h后測大鼠空腹血糖濃度(BG)，

4、BG＞16.7mmol/L，11周后糖尿病組大鼠的空腹血糖濃度(BG)＞16.7mmol/L，說明糖尿病大鼠并發(fā)膀胱病變。
　　2.標本的制作及免疫組化：
　　大鼠麻醉后，分別取實驗組和對照組大鼠膀胱及腰骶背根神經(jīng)節(jié)，生理鹽水沖洗一次，放入4％多聚甲醛(0.1MPBS，PH7.0～7.6，含0.1％DEPC)瓶中進行固定，取0.5cm×0.5cm×0.1cm組織塊放入Citadel2000型脫水機進行脫水處理后，高溫熔解固體

5、石蠟，在模具內(nèi)包埋組織塊；
　　免疫組化的試劑是采用河北博海生物工程開發(fā)有限公司分裝美國SANTACRUZ公司產(chǎn)品，按照說明書操作，具體步驟為：
　　(1)將厚度5um的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜；(2)將切片放入二甲苯和酒精中脫蠟、入水(二甲苯中5分鐘兩次、100％乙醇5分鐘兩次、95％乙醇5分鐘兩次、90％乙醇5分鐘兩次、85％乙醇5分鐘兩次、75％乙醇5分鐘兩次)蒸餾水洗兩次；(3)將切片放入檸

6、檬酸抗原熱修復(fù)液中，微波爐加熱后冷卻至室溫(100％火力一分鐘、20％火力一分鐘、停一分鐘，共四次)，用蒸餾水沖洗；(4)加3％H2O2孵育10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物的活性，蒸餾水沖洗1次，0.1MPBS洗2次(每次5分鐘)；(5)切片上滴加正常的山羊血清封閉液，在室溫下放置20分鐘。甩去多余的液體，不洗；(6)切片上滴加適當比例(1:300)的第一抗體，放在冰箱內(nèi)4℃過夜，取出切片，0.1MPBS洗2次(每次5分鐘)；(7)切片上滴

7、加生物素化第二抗體(IgG)，在37℃環(huán)境下放置20分鐘，0.1MPBS洗2次(每次5分鐘)；(8)切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，放在37℃環(huán)境下20分鐘，0.1MPBS洗2次(每次5分鐘)，拭干；(9)DAB顯色：DAB顯色試劑盒加入1ml蒸餾水，再將顯色劑A、B、C各一滴加入試劑盒內(nèi)，混勻，加至標本上，顯色1分鐘(顯微鏡下觀察顯色效果)，充分水洗；(10)蘇木素復(fù)染細胞核1分鐘，取出充分水洗，使其返藍復(fù)染、

8、脫水、烘干(1％鹽酸酒精分化、1％胺水反藍、充分水洗、經(jīng)70％乙醇5分鐘、80％乙醇5分鐘、90％乙醇5分鐘兩次、95％乙醇5分鐘兩次、100％乙醇5分鐘兩次脫水、二甲苯透明5分鐘兩次)、中性樹脂封片；(11)結(jié)果的觀察：光學顯微鏡下觀察，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞，根據(jù)著色強度和陽性細胞的百分比，選擇實驗組和對照組的陽性和陰性組織相，進行100×和400×的顯微照相，讀取數(shù)據(jù)。
　　3.統(tǒng)計學分析：

9、　　應(yīng)用SPSS13.0軟件包，血糖結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示，進行兩個獨立樣本t檢驗，當P值＜0.05時具有統(tǒng)計學意義；IGF在膀胱及DRG中的表達屬于等級資料，需采用秩和檢驗，當P值＜0.05時具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.血糖的變化
　　大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素72h后，血糖明顯升高(BG＞16.7mmol/L)，取材時，糖尿病組(n=19)的血糖明顯高于對照組(n=15)，兩組屬于計量資料，采用兩個獨立樣本

10、的t檢驗，對照組與糖尿病組比較(4.7333±0.61721vs29.52±1.62241)，P=0.000，P值＜0.05，統(tǒng)計學上有顯著的差異，說明本實驗STZ造模成功，結(jié)果見Table.1及Fig.1。
　　2.HE染色與免疫組化結(jié)果
　　光鏡下見大鼠膀胱逼尿肌結(jié)構(gòu)如下：對照組大鼠膀胱移行上皮排列整齊，粘膜下及肌間神經(jīng)叢多見，肌纖維整齊排列，肌束間排列緊密，肌間隙內(nèi)充滿結(jié)締組織，肌細胞大小一致；糖尿病組大鼠粘膜下有炎細

11、胞浸潤，肌束排列紊亂、結(jié)構(gòu)松散，肌間隙明顯增寬，肌束間血管充血，逼尿肌細胞肥大，形態(tài)不規(guī)則。根據(jù)上述結(jié)果，說明糖尿病性膀胱病大鼠造模成功。
　　免疫組化結(jié)果：IGF-1在膀胱粘膜下和膀胱逼尿肌細胞分布，與正常組相比，糖尿病表達明顯下降；IGF-1在膀胱及DRG中的表達，結(jié)果屬于等級資料，統(tǒng)計學上采用秩和檢驗，統(tǒng)計學結(jié)果如圖表1所示：Mann-whitneyU統(tǒng)計量為49.000；WilcoxonW統(tǒng)計量為239.000；Z=-3.

12、354，雙側(cè)檢驗P=0.001，按α=0.05標準，說明糖尿病組IGF-1在膀胱中的表達明顯下調(diào)具有統(tǒng)計學意義；在腰骶背根神經(jīng)節(jié)中，IGF-1主要分布在細胞漿內(nèi)，與正常組相比，糖尿病組表達明顯降低，統(tǒng)計學結(jié)果如圖表2所示：Mann-whitneyU統(tǒng)計量為9.000；WilcoxonW統(tǒng)計量為54.000；Z=-2.911，雙側(cè)檢驗P=0.004，按α=0.05標準，說明糖尿病組大鼠IGF-1在腰骶背根神經(jīng)節(jié)的表達明顯下調(diào)有統(tǒng)計學意義。