雞小腸隱窩的分離培養(yǎng)及其特性的研究.pdf

1、小腸是動物消化和吸收的重要器官，小腸黏膜是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵部位。小腸上皮細胞向下移動凹陷后形成隱窩結(jié)構(gòu)，大約6～10個隱窩支持一條小腸絨毛的生長與代謝。隱窩是小腸上皮細胞的生長源頭，在隱窩的內(nèi)部存在小腸干細胞和潘氏細胞。隱窩在小腸的更新中起著十分重要的作用。本實驗采用低溫酶消化并結(jié)合離子螫合劑的方法分離和純化兩周齡雞小腸的隱窩，并將分離到的隱窩進行培養(yǎng)，然后檢測隱窩的進行形態(tài)變化、標(biāo)記基因表達和細胞增殖活性，旨在建立雞小腸隱窩的分離和培

2、養(yǎng)方法，為家禽小腸更新和功能的研究提供實驗技術(shù)平臺。
　　1，小腸隱窩的分離和培養(yǎng)
　　小腸隱窩是小腸上皮細胞下陷而形成的特殊壁龕樣的結(jié)構(gòu)，在隱窩中存在特殊的小腸上皮細胞如潘氏細胞和小腸干細胞。本實驗以兩周齡的海蘭雞小腸作為材料，通過低溫物理方法，在離子螯合劑中孵育小腸片段以分離隱窩。剛分離得到的大量絨毛碎片以及單個細胞在孵育振蕩后顯微鏡下檢查，可觀察到絨毛-隱窩單位，更換新的分離液后繼續(xù)孵育隱窩，可得到大量小腸隱窩。用20

3、0目篩網(wǎng)過濾以及梯度離心的方法純化隱窩，顯微鏡下檢查計數(shù)，每只雛雞可獲得15000個左右結(jié)構(gòu)完整的隱窩。將分離的隱窩按200個左右/50μl液體的密度接種到Matrigel立體培養(yǎng)基中，同時加入三組不同濃度的添加物，包括表皮生長因子(EGF)、Noggin和R-Spondin，然后觀察隱窩的生長情況，最終確定隱窩培養(yǎng)基的成分為500μg/ml EGF、100μg/ml Noggine和1000μg/ml R-spondin。隱窩在體外可

4、以生長達到9d，并且保持結(jié)構(gòu)完整，隱窩直徑從80μm增大到200μm以上，增幅達200％以上。
　　2，培養(yǎng)的雞小腸隱窩特性的研究
　　雞小腸隱窩體外培養(yǎng)會形成規(guī)則的球體。透射電鏡觀察結(jié)果表明，培養(yǎng)的隱窩結(jié)構(gòu)完整。干細胞標(biāo)記物Ascl2、Znrf3、Olfm4、Lgr5、HopX的mRNA表達檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的隱窩可表達上述所有小腸千細胞的標(biāo)記基因。中性紅染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)的隱窩被染成紅色，說明培養(yǎng)的隱窩具有良好的活性;5

5、-Ethyny1-2'-deoxyuridine摻入實驗表明，隱窩中存在部分陽性細胞，這些陽性細胞是增殖的細胞。添加CHIR99021（Wnt通路中糖原合成激酶GSK3β的阻斷劑）后發(fā)現(xiàn)，隱窩增長速度加快，體積變大，最大直徑達到300μm。以上結(jié)果表明，本實驗培養(yǎng)的隱窩不僅可以在體外維持存活，細胞具有增殖活性，而且可對刺激物CHIR99021的處理有應(yīng)答。
　　綜上所述，本實驗建立了雞小腸隱窩的分離和培養(yǎng)方法，培養(yǎng)的隱窩可形成球形