線粒體基因組拷貝數(shù)與高原習(xí)服相關(guān)性及二十八烷醇促高原習(xí)服效應(yīng)的初步研究.pdf

1、缺氧是常見的病理過程，也是高原環(huán)境影響人體的主要因素。線粒體是機(jī)體氧利用的主要場(chǎng)所，是進(jìn)行氧化磷酸化的重要結(jié)構(gòu)，堪稱細(xì)胞的“能量工廠”。肝臟是重要的代謝器官，其代謝、合成、分泌、解毒、免疫等功能非?；钴S。肝線粒體能量代謝旺盛，其能量的合成和利用在其功能正常發(fā)揮中起重要作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，急性缺氧可以抑制mtDNA(nutochondrial DNA，mtDNA)轉(zhuǎn)錄和翻譯，損害線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，而慢性缺氧時(shí)線粒體功能得到一定程度的恢

2、復(fù)，這種線粒體功能的改變是機(jī)體低氧習(xí)服的一個(gè)重要機(jī)制。線粒體功能的改變不僅與其結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，還與線粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)變化、線粒體基因組序列和數(shù)目的變化有關(guān)。 第一部分大鼠肝組織線粒體基因組拷貝數(shù)在高原習(xí)服過程中的變化及其意義的初步研究 有關(guān)缺氧過程中線粒體基因組拷貝數(shù)的變化及其意義少見報(bào)道。本文通過研究模擬高原缺氧習(xí)服過程中肝組織線粒體基因組拷貝數(shù)的變化，血漿活性氧、肝組織線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基mRNA表達(dá)、肝組

3、織線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性、肝組織線粒體呼吸功能、肝組織線粒體結(jié)構(gòu)及肝功能等的變化，探討線粒體基因組拷貝數(shù)在高原習(xí)服過程中的變化規(guī)律及其在高原習(xí)服中的意義。 方法: 健康雄性成年SD大鼠在低壓艙內(nèi)模擬海拔5000m高原分別減壓5天(缺氧5 d)、15天(缺氧15 d)和30天(缺氧30 d)，23 h/d，同時(shí)設(shè)立平原對(duì)照組。缺氧各組和對(duì)照組大鼠分別在模擬的5000米海拔高度和平原頸動(dòng)脈插管取血，用于檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)胺酶(al

4、anine aminotransferase，ALT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、同型半胱氨酸(homocysteic acid，Hcy)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)。 隨后，將各組大鼠斷頭處死，分離大鼠肝臟線粒體，采用Clark氧電極法測(cè)定線粒體復(fù)合酶Ⅳ(細(xì)胞色素氧化酶)活性和氧化呼吸活性；提取肝臟組織總DNA，采用定量PCR檢測(cè)肝線粒體基因組拷貝數(shù)；提取肝臟組織

5、總RNA，采用定量RT-PCR檢測(cè)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(nutochondrial transcription factor A，mtTFA)，細(xì)胞色素氧化酶亞基I、II、III(COX I，cox II，COXIII) mRNA表達(dá)量。 結(jié)果: 1.各缺氧組大鼠動(dòng)脈血漿MDA含量顯著高于平原對(duì)照組，其中，缺氧15d組顯著高于缺氧5d組和30d組；各缺氧組血漿Hcy含量和SOD活力顯著低于平原對(duì)照組，其中，缺氧15d組顯著低

6、于缺氧5d組和30d組。 2.缺氧15d組和30d組大鼠肝組織線粒體基因組拷貝數(shù)顯著高于平原對(duì)照組和缺氧5d組。 3.缺氧15d組和30d組大鼠肝組織mtTFA mRNA表達(dá)量顯著高于平原對(duì)照組和缺氧5d組。 4.大鼠肝組織mtTFA mRNA表達(dá)量、mtDNA拷貝數(shù)與動(dòng)脈血漿中MDA含量成正相關(guān)，與血漿中Hcy含量及SOD活力成負(fù)相關(guān)，mtDNA拷貝數(shù)與mtTFA mRNA表達(dá)量成正相關(guān)。 5.缺氧15

7、d組和30d組大鼠肝mtDNA編碼的COX I、coxII、COXIII的mRNA表達(dá)量顯著高于平原對(duì)照組和缺氧5d組。 6.缺氧各組大鼠肝組織線粒體復(fù)合酶Ⅳ活性顯著低于平原對(duì)照組，其中，缺氧30d組較缺氧15d組有顯著上升。缺氧各組大鼠肝線粒體III態(tài)呼吸(ST3)、呼吸控制率(RCR)和氧化磷酸化效率(OPR)均顯著低于平原對(duì)照組，其中，缺氧30d組RCR、OPR較缺氧15d組有顯著上升；缺氧各組肝線粒體Ⅳ態(tài)呼吸(ST4)顯

8、著高于平原對(duì)照組，其中，缺氧30d組較缺氧15d組有顯著下降。 7.模擬高原(5000 m)連續(xù)缺氧5天和15天，部分肝線粒體出現(xiàn)變性水腫，膜結(jié)構(gòu)不清、嵴紊亂、無序。模擬高原(5000 m)連續(xù)缺氧30天，肝線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)與平原對(duì)照組比較無明顯差異。 8.缺氧5d組和15d組大鼠動(dòng)脈血清ALT水平顯著高于平原對(duì)照組，缺氧30d組較缺氧15d組有顯著降低，且與平原對(duì)照組比較無顯著性差異。 結(jié)論: 1.模擬高

9、原缺氧習(xí)服過程中大鼠肝組織mtDNA拷貝數(shù)顯著增高，其變化與機(jī)體抗氧化能力降低呈負(fù)相關(guān)，與活性氧增多和肝組織線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)的mRNA表達(dá)增強(qiáng)呈正相關(guān)，提示缺氧時(shí)機(jī)體活性氧水平升高、mtTFA表達(dá)上調(diào)可能是線粒體基因組拷貝數(shù)增加的重要機(jī)制。 2.模擬高原缺氧習(xí)服過程中肝組織線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I、II、III mRNA表達(dá)量顯著增加、線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性逐漸恢復(fù)、線粒體氧化磷酸化功逐漸改善，其機(jī)制可能與mt

10、DNA拷貝數(shù)增加有關(guān)。換言之，缺氧過程中mtDNA拷貝數(shù)增加可能是機(jī)體習(xí)服高原缺氧環(huán)境的重要機(jī)制。 3.缺氧可使肝結(jié)構(gòu)和功能受損，隨著習(xí)服時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟結(jié)構(gòu)和功能的改變逐漸恢復(fù)，其機(jī)制與缺氧習(xí)服過程中線粒體功能的恢復(fù)有關(guān)。 總之，缺氧習(xí)服過程中，肝組織mtDNA拷貝數(shù)增多可能是線粒體功能和肝臟功能改善的重要原因，這可能是機(jī)體對(duì)高原習(xí)服的重要機(jī)制。 第二部分二十八烷醇促高原習(xí)服效應(yīng)的機(jī)制研究 二十八烷醇(

11、1-Octacosanol)是一種天然存在的高級(jí)脂肪醇，具有多種生理功能，且來源廣泛，無副作用。我們?cè)谝酝难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，二十八烷醇具有明顯的抗缺氧功效。對(duì)其抗缺氧作用機(jī)制的迸一步研究發(fā)現(xiàn)，其抗缺氧作用環(huán)節(jié)不在于改善機(jī)體血氧運(yùn)輸效率。為了進(jìn)一步明確其抗缺氧作用的環(huán)節(jié)，本研究建立了慢性缺氧大鼠模型，探討二十八烷醇是否通過改善線粒體功能來發(fā)揮其抗高原缺氧作用。 方法: 健康雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為給藥組和對(duì)照組，兩組大鼠置于模

12、擬海拔5000 m高原的低壓艙內(nèi)減壓30 d，23 h/d。給藥組按5 mg.kg-1劑量給予0.5％(m/v)二十八烷醇懸濁液灌胃，連續(xù)30 d，每天1次，對(duì)照組給予1ml.kg-1食用油灌胃。給藥組和對(duì)照組大鼠均在模擬海拔5000 m取材。檢測(cè)指標(biāo)和方法同第一部分。 結(jié)果: 1.5 mg.kg-1二十八烷醇給藥組大鼠動(dòng)脈血漿MDA含量顯著低于對(duì)照組，血漿Hcy含量和SOD活力顯著高于對(duì)照組。 2.5mg.kg

13、-1二十八烷醇給藥組大鼠肝組織mtTFA mRNA表達(dá)量、mtDNA拷貝數(shù)、COX I、COXII、COXIII mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較無顯著性差異。 3.5mg.kg-1二十八烷醇給藥組大鼠肝線粒體復(fù)合酶Ⅳ活性顯著高于對(duì)照組，ST3與對(duì)照組無顯著性差異，ST4顯著低于對(duì)照組，RCR、OPR顯著高于對(duì)照組。 4.慢性缺氧對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多、水腫、擴(kuò)張，大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解、脫顆粒，5 mg.kg-1二十八烷醇給藥組

14、大鼠肝組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常改變。 5.5mg.kg-1二十八烷醇給藥組大鼠動(dòng)脈血清ALT水平顯著低于對(duì)照組。 結(jié)論: 1.二十八烷醇可以顯著改善慢性缺氧引起的肝臟結(jié)構(gòu)和功能損傷，具有良好的促進(jìn)高原習(xí)服的作用。 2.二十八烷醇可以顯著上調(diào)慢性缺氧大鼠肝線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性，提高肝線粒體氧化呼吸效率和ATP合成率，這可能是其促進(jìn)高原習(xí)服的重要機(jī)制。 3.二十八烷醇對(duì)慢性缺氧大鼠肝組織mtTFA m

15、RNA表達(dá)、mtDNA拷貝數(shù)、細(xì)胞色素氧化酶亞基I、II、III mRNA的表達(dá)無顯著影響，但可以顯著提高機(jī)體的抗氧化能力，降低機(jī)體活性氧水平，減輕氧化損傷，這可能是其促進(jìn)高原習(xí)服的重要機(jī)制。 總之，二十八烷醇可提高機(jī)體抗氧化能力，降低機(jī)體活性氧水平，減輕氧化損傷，提高細(xì)胞色素氧化酶活性和線粒體功能，改善肝功能，促進(jìn)高原習(xí)服。 總之，缺氧習(xí)服過程中，肝組織mtDNA拷貝數(shù)增多可能是線粒體功能和肝臟功能改善的重要原因，這可