高原習服及習服不良過程中基因表達特征及其病理生理學意義研究.pdf

1、目的:
　　基因表達變化是轉(zhuǎn)錄組學研究的核心內(nèi)容，細胞轉(zhuǎn)錄組具有時空特異性，隨時間和空間的改變而改變，因此基因表達變化是細胞維持穩(wěn)態(tài)和改變自身狀態(tài)的主要途徑。對基因表達進行分析是研究復雜表型分子機制的重要研究手段，且轉(zhuǎn)錄組學產(chǎn)生的富含大量生物學信息的基因表達數(shù)據(jù)為系統(tǒng)性的研究復雜表型的分子基礎(chǔ)提供了可能。因此本文圍繞“高原習服及習服不良過程中基因表達特征及其病理生理學意義”這一主題，從兩個部分詳細開展研究。
　　第一部分，對

2、漢族人群進入高原前、進入高原早期、中期、后期以及返回平原早期和后期進行了連續(xù)動態(tài)的觀察。在此期間，采集個體生理數(shù)據(jù)及臨床癥狀表型，使用RNA-Seq技術(shù)檢測全血細胞基因表達情況，采用WGCNA算法尋找各時間階段特異表達基因，結(jié)合基因注釋數(shù)據(jù)庫以及文獻對其病理生理學意義進行研究，深入了解高原習服的本質(zhì)。第二部分，比較AMS和HAPC患者與未患病者高原低氧暴露后基因表達變化，構(gòu)建并比較AMS和HAPC患者和未患病者差異表達基因共表達網(wǎng)絡(luò)，從

3、網(wǎng)絡(luò)水平研究與AMS和HAPC發(fā)生相關(guān)的基因共表達模式及其關(guān)鍵基因，為高原病發(fā)病機制的研究提供重要的線索。
　　方法:
　　1.本研究分別進行了2次獨立的人群實驗:①動態(tài)觀察16名健康男性漢族志愿者人群進入高原前、進入高原(5300m)早期(3d)、中期(4m)、后期(1y)以及返回平原早期(1m)和后期(6m)血壓、心率及血氧飽和度變化，同時采集靜脈血用于RNA-Seq測序、血紅蛋白濃度檢測以及血漿細胞因子檢測;②采集10

4、9名健康男性漢族志愿者進入高原前的靜脈血，分離血漿用于microRNA表達譜測定，觀察記錄志愿者進入高原(3658m)后AMS的發(fā)病情況及癥狀評分。
　　2.提取全血細胞總RNA，構(gòu)建PE測序文庫，采用Illumina HiSeq2000測序平臺進行RNA-Seq測序。
　　3.采用BGI標準數(shù)據(jù)處理流程評估RNA-Seq原始序列數(shù)據(jù)質(zhì)量并比對到人類參考基因組(hg19);采用FPKM值對基因表達值進行標準化和定量，R軟件包

5、edgeR分析組間差異表達基因，取|Fold change|≥2且FDR＜0.05為閾值;采用WGCNA算法對基因表達量進行系統(tǒng)分析，根據(jù)基因表達相似性劃分基因模塊，獲取進入高原早期、中期、后期以及返回平原早期及后期特異表達基因并根據(jù)基因間關(guān)聯(lián)度構(gòu)建各自共表達網(wǎng)絡(luò);使用clusterProfiler軟件包及在線分析工具REVIGO對各階段特異表達基因進行生物學注釋;結(jié)合已報道文獻對網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因的生物學功能進行詳細探討。
　　4.

6、使用RPKM標準化和定量AMS患者與未患病者轉(zhuǎn)錄本表達量;采用densitybased pruning算法篩選AMS患者和未患病者急進高原前后差異表達轉(zhuǎn)錄本;使用DAVID中Gene Functional Classification工具對差異表達轉(zhuǎn)錄本進行生物學注釋并歸類;根據(jù)聚類網(wǎng)絡(luò)理論計算AMS患者與未發(fā)病者進入高原后基因的拓撲重合矩陣OT(i，j)，并構(gòu)建比較兩者基因共表達網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)。
　　5.使用ELISA法對AMS

7、患者和未患病者血漿中IL10、CCL8及IL17F含量進行檢測;采用化學發(fā)光法對AMS患者和未患病者IL10含量進行重復性驗證。
　　6.使用miRCURYTM LNA Array檢測健康男性漢族志愿者進入高原前血漿中microRNA表達譜;使用qRT-PCR法對差異microRNA進行驗證并使用R軟件包OptimalCutpoints對其在AMS發(fā)病風險中的預測效能進行評價。
　　7.使用microT-CDS和TarBas

8、e工具對microRNA的調(diào)控靶基因進行分析;使用DIANA-miRPath對microRNA靶基因進行生物學注釋。
　　結(jié)果:
　　1.進入高原早期，參與多巴胺代謝、離子轉(zhuǎn)運及血紅蛋白合成的基因特異性表達，基因MXI1、RNF10、TRIM58、GLRX5和BPGM處于共表達網(wǎng)絡(luò)的中心位置;中期，基因表達模式與進入高原前相似;后期，參與磷代謝、免疫系統(tǒng)與MAPK信號通路調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)吞及囊泡轉(zhuǎn)運的基因特異性表達，基因SMAR

9、CD2、CDK9及RIC8A處于共表達網(wǎng)絡(luò)的中心位置。
　　2.返回平原早期，參與大分子物質(zhì)、核酸代謝，細胞增殖分化的基因特異性表達，基因MTF2、ZFR、CAND1、DEPDC1、DEPDC1B、CCNA2、CDC6、CDC20、CCNB2、CCNB1和ANLN處于共表達網(wǎng)絡(luò)的中心位置;后期參與免疫炎癥反應(yīng)的基因特異性表達，基因ZBP1、STAT2、IFIT1、IFIT2和IFIT3處于共表達網(wǎng)絡(luò)的中心位置。
　　3.與A

10、MS未發(fā)病者相比，免疫和炎癥反應(yīng)在AMS患者差異表達轉(zhuǎn)錄本中顯著富集(富集分數(shù):3.44，3.27);AMS患者與未患病者基因共表達網(wǎng)絡(luò)中IL10、CCL8和IL17F的度存在顯著差異;蛋白水平上，進入高原后AMS患者IL10的表達顯著下調(diào)，CCL8和IL17F顯著增加，未發(fā)病者IL10顯著上調(diào)，IL17F顯著下調(diào)，CCL8改變無統(tǒng)計學差異;且在另一人群中，急進高原后，AMS患者IL10蛋白顯著下調(diào)(p=0.001)，未患病者無顯著改變

11、，IL10的改變量與急進高原個體臨床癥狀評分間存在較強的相關(guān)性，r(22)=-0.52，p=0.013。
　　4.進入高原前，AMS患者血漿miR-369-3p、miR-449b-3p和miR-136-3p表達量顯著高于未患病者;采用Logistic回歸模型發(fā)現(xiàn)miR-369-3p、miR-449b-3p和miR-136-3p組合對AMS發(fā)病風險預測的敏感度和特異度達到92.68％和93.48％，AUC:0.986，95％CI:0

12、.970-1.000，p＜0.001，LR+:14.21，LR-:0.08;生物信息學分析提示miR-369-3p，miR-449b-3p和miR-136-3p調(diào)控的靶基因主要參與含氮化合物的代謝過程及神經(jīng)營養(yǎng)因子TRK受體信號通路。
　　5.HAPC患者較未發(fā)病者具有311個特有的差異上調(diào)基因，顯著富集于細胞增殖以及免疫調(diào)控過程;進入高原后，HAPC患者表達上調(diào)基因共表達網(wǎng)絡(luò)平均度為22.64，是未患病者的2倍(11.85);

13、HAPC患者差異上調(diào)基因共表達網(wǎng)絡(luò)中，中心性(Betweenesscentrality)較高的基因為IFT20和MRPL22，分別為0.50和0.46，未患病者中，中心性較高的基因為ITGAV和TPRKB，分別為0.50和0.37。
　　結(jié)論:
　　1.進入高原早期，機體以MXI1、RNF10、TRIM58、GLRX5及BPGM為核心表達基因，調(diào)控參與多巴胺代謝、離子轉(zhuǎn)運及血紅蛋白合成基因，提示在高原習服早期，機體主要通過增

14、加氧氣攝入、運輸以及氧合血紅蛋白氧釋放效率等適應(yīng)高原環(huán)境，以實現(xiàn)機體內(nèi)、外環(huán)境的基本平衡;隨著高原暴露時間的延長，機體調(diào)動更多內(nèi)在機制參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，其中以SMARCD2、CDK9及RIC8A為核心表達基因。這些基因通過調(diào)控參與磷代謝、免疫系統(tǒng)與MAPK信號通路調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)吞及囊泡轉(zhuǎn)運的基因，促進紅細胞增殖增加氧的運輸，促進組織血管新生縮短氧的彌散距離以及增強組織細胞對氧的利用等多種機制習服高原環(huán)境。在此過程中，機體的免疫系統(tǒng)激活

15、，其意義可能在于防御低氧損傷，確保機體自身穩(wěn)定。
　　2.從高原返回平原早期，機體以MTF2、DEPDC1、DEPDC1B、CCNA2、CDC6、CDC20、CCNB2、CCNB1和ANLN為核心表達基因，通過調(diào)控細胞的增殖分化，建立內(nèi)環(huán)境平衡狀態(tài);后期以ZBP1、STAT2及IFIT家族為核心表達基因，參與并增強免疫炎癥反應(yīng)，清除內(nèi)源性損傷因子并修復損傷組織。
　　3.炎癥反應(yīng)增強是AMS發(fā)生的重要機制。高原低氧引起AMS

16、患者基因共表達模式改變，導致抗炎因子IL10分泌減少，促炎細胞因子CCL8和IL17F分泌增加，可能是促使炎癥反應(yīng)增強進而發(fā)生AMS的重要機制。
　　4.漢族人進入高原前的血漿microRNA水平與AMS的發(fā)病風險密切相關(guān)，其中血漿miR-369-3p、miR-449b-3p和miR-136-3p分子組合對AMS的發(fā)病風險具有很好的預測效能，提示其是一種新的預測AMS易感性的生物標志物。
　　5.參與細胞增殖以及免疫反應(yīng)的基

17、因過度上調(diào)以及基因間特有的共表達關(guān)系與HAPC的發(fā)生密切相關(guān)，其中以IFT20和MRPL22的作用尤為關(guān)鍵，提示其可能是HAPC發(fā)病的重要環(huán)節(jié)和防治的重要靶點。
　　綜上所述，本論文采用RNA-Seq技術(shù)首次對漢族人群進入高原前，進入高原早期、中期和后期以及返回平原早期和后期全過程全血細胞基因表達進行了動態(tài)觀察，從系統(tǒng)的角度對高原習服及脫習服過程中不同時間段特異表達基因及其病理生理學意義進行了研究，為理解高原習服的本質(zhì)提供了重要的