條件性敲除Indian Hedgehog對出生后小鼠生長板骨化早期的影響.pdf

1、目的:
　　1、觀察條件性敲除Ihh對小鼠股骨、脛骨長度的影響；
　　2、觀察Ihh基因條件性敲除小鼠生長板開始骨化前后一天生長板組織形態(tài)學變化，以期觀察到四個區(qū)的演變過程；
　　3、初步探討Ihh對生長板骨化早期的影響機制；
　　4、為Ihh異常導致的相關疾病如：BDA1、骨關節(jié)炎、骨質疏松等疾病的防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、取基因型為Col2α1-CreERT2；Ihhfl/fl的剛出

2、生小鼠28只，隨機分為實驗組Ta組(6天組)、對照組Ca組（6天組），每組14只。再取Col2α1-CreERT2；Ihhfl/fl的小鼠12只，隨機分為實驗組Tb組（8天組）、對照組Cb組（8天組），每組6只。實驗組于出生后第一天開始腹腔注射玉米油溶解的TM（Tamoxifen）連續(xù)注射3天。對照組腹腔注射等量的玉米油作為對照。
　　2、RT-PCR檢測實驗組Ta組、對照組Ca組,脛骨近端骨骺中Ihh基因mRNA的相對表達量，明

3、確其敲除率（n=6）。
　　3、測量Ta、Ca、Tb、Cb組左股骨、左脛骨長度，觀察對股骨、脛骨長度的影響（n=6）。
　　4、小鼠左脛骨近端X照射及組織切片Von kossa染色，明確實驗組脛骨近端生長板開始骨化的前一天。
　　5、小鼠左脛骨近端生長板組織切片番紅O染色，觀察脛骨近端生長板形態(tài)學變化。
　　6、RT-PCR檢測實驗組小鼠脛骨近端生長板開始骨化前一天，脛骨近端骨骺中RUNX2基因mRNA表達水平的

4、變化（n=6）。
　　結果：
　　1、實驗組Ta組骨骺中Ihh基因表達量明顯低于對照組Cb組（P＜0.05），基因敲除率為65.17％。
　　2、出生后第6天及出生后第8天，實驗組股骨長度、脛骨長度較對照組股骨長度、脛骨長度明顯縮短（P＜0.05）。
　　3、脛骨近端X線及生長板組織切片Von Kossa染色均發(fā)現(xiàn)小鼠在出生后第6天，生長板均未發(fā)生骨化，而實驗組出生后第8天，生長板骨化明顯。確認條件性敲除Ihh生

5、長板開始骨化前一天為出生后第6天。
　　4、實驗組番紅O染色顯示：生長板組織結構紊亂，增殖區(qū)消失，未發(fā)現(xiàn)典型的排列成柱狀的增殖區(qū)細胞，生長板被肥大軟骨細胞所占據(jù)，蛋白聚糖分泌減少，分布紊亂。對照組脛骨近端生長板組織結構正常。
　　5、實驗組開始骨化前一天脛骨近端骨骺組織RUNX2基因表達量明顯高于對照組（P＜0.05）。
　　結論：
　　條件性敲除生長板來源的Ihh導致小鼠脛骨、股骨長度縮短，脛骨近端生長板組織結