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文檔簡介
1、目的:
1、觀察 Ihh(印度刺猬蛋白)基因敲除后小鼠生長板大體結(jié)構(gòu)及其內(nèi)軟骨細(xì)胞形態(tài)分布的改變;
2、觀察Ihh基因敲除后小鼠骨骺內(nèi)(本應(yīng)形成生長板的區(qū)域)礦化現(xiàn)象改變的具體過程及特點(diǎn);
3、初步觀察Ihh基因敲除后小鼠生長板內(nèi)Ihh下游相關(guān)因子PTHrP及BMP-6的表達(dá)變化趨勢。
方法:
用基因型為 Ihhfl/fl和 Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl的基因工程小鼠
2、繁殖,并用RT-PCR技術(shù)鑒定新生小鼠基因型。將鑒定出的剛出生的基因型為 Col2a1-Cre ERT2;Ihhfl/fl小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組。于小鼠出生后第一天及第二天,實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射雌激素受體拮抗劑 TM(托馬西酚)溶液誘導(dǎo)敲除 Ihh基因,對照組小鼠腹腔注射同等量植物油。完成Ihh基因敲除后:①取小鼠出生后第14天,觀察兩組小鼠大體照,并行下肢X線觀察小鼠下肢脛骨。②分別在小鼠出生后第6、8、10、12、14天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)
3、通過番紅O染色觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組骨骺內(nèi)各種類型軟骨細(xì)胞形態(tài)和分布的特點(diǎn)及變化,③及通過Vonkasso(礦化)染色觀察骨骺礦化過程的變化。④用出生后第6天小鼠通過免疫組織化學(xué)染色初步觀察Ihh下游相關(guān)因子甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(BMP-6)的表達(dá)變化趨勢。
結(jié)果:
第六天實(shí)驗(yàn)組小鼠番紅 O染色顯示脛骨近端骨骺無明顯的按軟骨細(xì)胞成熟程度形成的結(jié)構(gòu)分區(qū),但有大量異常出現(xiàn)的大而圓的肥大軟骨細(xì)胞充
4、填在骨骺內(nèi),而幾乎觀察不到扁平的呈柱狀排列的增殖形態(tài)軟骨細(xì)胞;對照組小鼠則顯示骨骺結(jié)構(gòu)發(fā)育良好且按軟骨細(xì)胞分化程度依次形成:靜止軟骨細(xì)胞區(qū)、增殖軟骨細(xì)胞區(qū)及肥大軟骨細(xì)胞區(qū)。第八天實(shí)驗(yàn)組小鼠番紅 O染色可見骨骺內(nèi)軟骨細(xì)胞進(jìn)一步成熟肥大,并通過 Vonkasso染色可見骨骺內(nèi)有數(shù)個(gè)礦化點(diǎn)出現(xiàn);而對照組小鼠骨骺內(nèi)則無礦化現(xiàn)象出現(xiàn)。第10天實(shí)驗(yàn)組小鼠Vonkasso染色可見骨骺內(nèi)出現(xiàn)大量礦化點(diǎn);而在對照組小鼠骨骺內(nèi)仍未發(fā)現(xiàn)礦化,但開始形成二次骨
5、化中心。第12天實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骺礦化現(xiàn)象延伸到骨骺大部分區(qū)域;而對照組小鼠骨骺二次骨化中心初步形成。第14天實(shí)驗(yàn)組小鼠礦化現(xiàn)象占據(jù)骨骺除未來形成關(guān)節(jié)軟骨的所有區(qū)域,且礦化密度增加,最終并無生長板結(jié)構(gòu)形成;而對照組小鼠二次骨化中心及生長板發(fā)育已完善。第6天實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骺PTHrP(聚集于增殖區(qū)軟骨細(xì)胞周圍)免疫組化染色較對照組小鼠明顯變淺,而BMP-6(表達(dá)于肥大區(qū)軟骨細(xì)胞內(nèi))則較對照組小鼠染色加深。第14天Ihh基因敲除組小鼠身長及四肢短
6、縮畸形最為明顯,并于X線下觀察下肢時(shí)發(fā)現(xiàn):對照組小鼠脛骨近端骨骺可見經(jīng)典生長板結(jié)構(gòu)(即骺線)及二次骨化中心結(jié)構(gòu),Ihh基因敲除組小鼠生長板結(jié)構(gòu)完全消失。
結(jié)論:
Ihh基因與小鼠生長板內(nèi)軟骨細(xì)胞按分化程度有序分區(qū)的現(xiàn)象密切相關(guān)。將小鼠Ihh基因敲除后,本應(yīng)未來形成生長板結(jié)構(gòu)區(qū)域的軟骨細(xì)胞過早肥大成熟、基質(zhì)礦化,導(dǎo)致正常生長板結(jié)構(gòu)難以形成,并可能會引起抑制軟骨細(xì)胞成熟的 PTHrP及促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟的BMP-6表達(dá)變化
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