卵巢癌診斷用HE4抗體的制備.pdf

1、卵巢癌是嚴(yán)重威脅廣大婦女的惡疾，由于發(fā)病部位隱匿，早期癥狀不明顯，卵巢癌死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首，70％～80％卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，五年生存率僅20％，而早期患者5年生存率可達(dá)70％～90％，所以提高卵巢癌早期診斷水平對(duì)提高其治愈率有重要意義，這也是目前婦科腫瘤研究關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)簡(jiǎn)便且無(wú)創(chuàng)，在腫瘤的篩查、診斷、指導(dǎo)治療、預(yù)后評(píng)價(jià)等方面有著非常廣泛的應(yīng)用前景。目前只有癌抗原125（cancer anti

2、gen 125，CA125）檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于臨床卵巢癌的診斷，大量研究證實(shí)CA125敏感性和特異性不高，對(duì)卵巢癌早期診斷率低。人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）是一種新的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物，最初是在人附睪上皮中發(fā)現(xiàn)的，可能有蛋白酶抑制劑的作用，但具體功能不詳。HE4 在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在卵巢癌診斷方面其靈敏度要明顯高于CA125，且能更好區(qū)分良性與惡性腫瘤，大量研

3、究證實(shí)HE4 是檢測(cè)早期卵巢癌的最佳標(biāo)志物之一。因此制備針對(duì)HE4的卵巢癌早期診斷試劑，對(duì)于提高卵巢癌患者的生存率有重要意義。
　　 傳統(tǒng)的抗體制備方法通常采用純化的蛋白質(zhì)來(lái)免疫動(dòng)物，但分離純化蛋白費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以獲得理想產(chǎn)品，有時(shí)即使獲得了目的蛋白，其免疫原性也很低（如某些原核表達(dá)蛋白），難以獲得理想的免疫效果。電穿孔輔助DNA 免疫能克服上述缺點(diǎn)。瞬時(shí)電場(chǎng)可使細(xì)胞生物膜產(chǎn)生可恢復(fù)的微孔，外源基因在電場(chǎng)力的作用下通過(guò)微孔進(jìn)入目標(biāo)

4、組織或器官，并在該組織或器官中直接表達(dá)目的抗原，引發(fā)免疫反應(yīng)。DNA 被細(xì)胞攝取后，基因半衰期延長(zhǎng)，可持續(xù)表達(dá)目的蛋白，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞記憶持久性；另外，電穿孔引起局部組織炎癥反應(yīng)，使大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提高了抗原遞呈效率，因此，電穿孔輔助DNA 免疫能獲得高效價(jià)的抗體。
　　 本研究利用RT-PCR從患者卵巢癌組織中獲取HE4基因編碼序列，通過(guò)T-A克隆將HE4基因克隆到pMD19T載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定后將其亞克隆至pPICZαA和

5、pcDNA3.1(+)表達(dá)載體中，并通過(guò)PCR、雙酶切及測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。將構(gòu)建好的pPICZαA-HE4表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染畢赤酵母GS115，在選擇培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性表達(dá)菌株，誘導(dǎo)其表達(dá)HE4重組蛋白，進(jìn)一步通過(guò)ELISA、Western-blot鑒定表達(dá)的HE4重組蛋白。通過(guò)考察不同甲醇濃度、pH、誘導(dǎo)時(shí)間、生物量及誘導(dǎo)溫度對(duì)HE4表達(dá)水平的影響，優(yōu)化了HE4誘導(dǎo)表達(dá)的條件。對(duì)含HE4重組蛋白的酵母培養(yǎng)上清采用鎳親和層析進(jìn)行純化。

6、另一方面，我們采用活體電穿孔法輔助pPICZαA-HE4和pcDNA3.1-HE4分別免疫BALB/c小鼠，通過(guò)B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合來(lái)制備單抗，經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，篩選出特異分泌鼠抗人HE4 mAb的雜交瘤細(xì)胞株。采用Western-blot，Ig亞型分析和mAb表位分析等對(duì)mAb的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　 研究結(jié)果顯示，成功從卵巢癌組織中獲取了HE4基因，并構(gòu)建了pcDNA3.1-HE4和pPICZαA-HE4兩個(gè)

7、真核表達(dá)載體；構(gòu)建的畢赤酵母能分泌表達(dá)HE4蛋白，表達(dá)的重組蛋白已被糖基化修飾并具有一定的空間構(gòu)象；HE4重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為：pH4.0，2％甲醇，2倍菌量，溫度26℃，誘導(dǎo)12h；從1L培養(yǎng)上清中，可純化出約10mg的HE4重組蛋白；單抗制備方面，獲得了2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人HE4 mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1-7-C和3-12-C，兩株單抗培養(yǎng)上清抗體效價(jià)分別為1:160和1:320，ELISA和Western-blot結(jié)