新型卵巢癌標(biāo)記物he4研究進(jìn)展

1、新型卵巢癌標(biāo)記物HE4的研究進(jìn)展,崔 恒北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科腫瘤中心,世界范圍統(tǒng)計資料,癌 新發(fā) 死亡 宮頸 470,000 230,000 卵巢 190,000 114,000 內(nèi)膜 188,000 45

2、,000,美國2008,卵巢癌的現(xiàn)狀,一個難題：無成熟的早期診斷方法；二個70%：確診時約70%已屬晚期；治療后即使是已達(dá)到臨床完全緩解的病人仍有70%最終將復(fù)發(fā)；三個進(jìn)展：手術(shù)病理分期、腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)、紫杉醇+卡鉑化療方案四個焦點：保留生育/生理功能、早期的輔助治療、晚期的治療、復(fù)發(fā)的診斷和治療,卵巢癌的診斷策略--早期診斷,卵巢癌的早期診斷一直是卵巢癌研究中最具挑戰(zhàn)性的課題腫瘤診斷的三大支柱圖像診斷：B超

3、 CT、MRI PET/CT血液與體液檢測：腫瘤標(biāo)記物細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)診斷,現(xiàn)階段卵巢癌的診斷,目前常用的診斷方法包括：1）婦科三合診；2）陰式彩色B超；3）血清CA125的檢測；4）計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射斷層掃描（PET或PET/CT）等,關(guān)于診斷正在研究中的有：放射免疫顯像（RII）新的或多種血清標(biāo)記物的檢測

4、血清中卵巢癌特異抗體的檢測惡性腫瘤危險指數(shù)評分（RMI)癌基因和抗癌基因突變的檢測，特別是與遺傳相關(guān)基因的檢測（芯片）發(fā)現(xiàn)和尋找新的特異抗原和基因,腫瘤標(biāo)記物的定義,與腫瘤相關(guān)的抗原或某種生物活性物質(zhì) 腫瘤細(xì)胞異常表達(dá) 反映癌變發(fā)生、發(fā)展過程 可被檢出,有效的腫瘤標(biāo)記物,特異性強敏感性高交叉反應(yīng)小早期診斷率高隨病情變化監(jiān)測值變化明顯,臨床應(yīng)用,腫瘤診斷及鑒別診斷 腫瘤殘存 復(fù)發(fā)的預(yù)測及復(fù)發(fā)部位監(jiān)測 療效觀察及預(yù)

5、后評估 對無癥狀早期癌及高危人群的篩查,血清腫瘤標(biāo)志物的檢測,CA125是應(yīng)用最多的卵巢癌血清腫瘤標(biāo)志物，特別是最常用的監(jiān)測卵巢癌復(fù)發(fā)的指標(biāo)。Ⅰ期卵巢癌患者僅有約30-50% ＞35u/ml，監(jiān)測復(fù)發(fā)的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值分別為79％、95％、100％。 1％健康婦女、3％良性卵巢腫瘤、6％非卵巢相關(guān)的良性疾病可有血清CA125水平升高。在子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔結(jié)核、炎癥等甚至高達(dá)50-70%,卵巢癌相關(guān)的其它標(biāo)志物,基因分析

6、和組織化學(xué)分析已發(fā)現(xiàn)許多新的可能與卵巢癌相關(guān)的標(biāo)志物MUC1Kallikreins：hK4, hK6, hK8, hK10MesothelinAntileukoproteinase 1 (ALP1)OsteopontinVEGFS100A1InhibinLPAB7-H4HE4，表達(dá)上調(diào)在卵巢癌中最常見，且在早、晚期患者中mRNA和蛋白的表達(dá)均上調(diào)。,HE4,HE4 （Human Epididymis Secret

7、ory Protein 4,人附睪分泌蛋白4） 1991年由Kirchhoff等從人的附睪中克隆出cDNA，基因定位在染色體 20q12-q13.1，全長為12kb左右，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，編碼的蛋白質(zhì)與細(xì)胞外蛋白酶抑制劑有很高的同源性，是一種酸性蛋白質(zhì)。1999年Schummer等發(fā)現(xiàn)HE4 mRNA在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中 不表達(dá)。HE4在惡性腫瘤中的高表達(dá)多見于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌，少見于肺腺癌及間

8、皮瘤。,HE4在早期（I期）的卵巢癌中的敏感性及檢測卵巢癌總的敏感性均高于CA125，是卵巢癌敏感及特異的標(biāo)志物，可用于對卵巢癌的早期診斷及輔助監(jiān)控卵巢癌患者的治療情況。 英國的一項研究對200，000婦女用30多種腫瘤標(biāo)記物分別單獨或與CA125聯(lián)合進(jìn)行卵巢癌篩查，HE4可以使診斷卵巢癌的敏感度和特異度提高,Biochemistry of HE4,HE4 - Human Epidiymis secretory protein 4M

9、ember of the WAP-gene family of protease inhibitors (new name WFDC-gene family)Characterized by an approx 50 aa sequence with 8 highly conserved cysteine residues that form 4 disulphide bridges.WFDC (Whey Acidic Protei

10、n Four Disulphide Core)Tumour associated WFDC-proteinsALP1, Elafin, HE4 (WFDC2), PS20 (WFDC1),HE4 mRNA expression profile,Restricted expression profile in normal tissueExpressed in normal epididymis, and

11、epithelia of the respiratory and reproductive tract Tumor-restricted expression in ovarian cancer > 90 % of serous ovarian cancerHE4 mRNA highly expressed in lung adenocarcinomas > 60 % high expression in AdC

12、< 10 % high expression in SqC,From Galgano et al Modern Pathol (2006)19; 847 - 853,Expression of HE4 mRNA in cancer,HE4 antigen expression in Ovarian cancer,Galgano et al Modern Pathol (2006)19; 847 - 853,HE4 antigen

13、 is highly expressed in serous, endometroid and clear cell ovarian cancerMucinous, germ cell or sex cord ovarian cancer barely express HE4,Drapkin et al Cancer Res (2005) 65;2162-2169,HE4 是一種適宜的卵巢癌血清標(biāo)志物,HE4 可分泌入體液 正常卵

14、巢不表達(dá)，而在卵巢癌高表達(dá)--特異性好 在早期和晚期HE4表達(dá)均呈高度上調(diào) – 早期病例具有高度敏感性 HE4的表達(dá)獨立于CA125的表達(dá) – 聯(lián)合檢測將較各自單獨檢測獲得更 多的信息,HE4診斷試劑盒,HE4 EIA試劑盒由瑞典Fujirebio Diagnostics AB公司生產(chǎn)，已經(jīng)獲得了FDA認(rèn)證和CE認(rèn)證，在美國、歐洲等多個國家上市銷售，現(xiàn)正在申請在中國上市注冊。 Fujirebio Diagnostics AB

15、公司研制的HE4 EIA試劑是國外唯一用于定量檢測人血清中HE4的試劑，國內(nèi)尚無任何檢測HE4的試劑上市銷售。,HE4 EIA 方法的建立,主要試劑：2H5 and 3D8 MAb established using HE4-Mouse Ig fusion protein as immunogen Hellstrom et al, Cancer Research 63, 3695 – 3700, 2003檢測原理：Two-step

16、 forward sandwich immunoassay based on Bio 2H5 MAb for catching of HE4 and HRP 3D8 MAb for detection,HE4 用于監(jiān)測卵巢癌,約 80%患者HE4與CA125相符，與病情一致,Study on 80 patients, 4,4 observations/patientMeasured concordance between biomar

17、ker change & clinical statusCompared HE4 and CA125,HE4 在卵巢癌的動態(tài)監(jiān)測中與CA125具有良好的互補性,Conclusion: HE4 and CA 125 show equivalent but complementary performance for monitoring of ovarian cancer,HE4 EIA中國注冊臨床試驗總結(jié)瑞典

18、康乃格公司市場部 2009年3月,臨床研究方案,樣本量及樣本量確定的依據(jù)根據(jù)國食藥監(jiān)械[2007]240號發(fā)布的《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（以下簡稱“臨床導(dǎo)則”），HE4 EIA屬于進(jìn)口三類體外診斷試劑。臨床導(dǎo)則要求臨床驗證至少要在三家省級以上醫(yī)院進(jìn)行實施，總樣本數(shù)不少于1000人份。,樣本選擇依據(jù)HE4 EIA試劑屬于國內(nèi)首次申請注冊的用于定量檢測患者血清中的HE4濃度，可用于上皮性卵巢癌患者的輔助診斷和療效監(jiān)測

19、。因此，臨床試驗收集的血清樣本包括：上皮性卵巢癌樣本、盆腔包塊疑似樣本、正常健康人樣本、其他腫瘤樣本、良性疾病樣本及干擾樣本等。同時包括臨床收集的跟蹤樣本。,入選標(biāo)準(zhǔn)：不同樣本組收集的血清，要求知道當(dāng)前受試者的臨床診斷。收集的血清樣本要求足夠用于試劑盒的檢測。樣本收集：根據(jù)樣本要求，醫(yī)院收集常規(guī)的血清樣本，要求標(biāo)記清楚。樣本保存：血清樣本在2-8℃條件下可以保存3天，或者 - 40℃下長期保存。

20、樣本運輸：血清樣本的運輸需要在2-8℃條件下進(jìn)行，樣本的使用不能超過限定時間。所有人體來源的樣本必須按照國家和國際的運輸規(guī)章運送。,金標(biāo)準(zhǔn)的確立：臨床采用病理檢測結(jié)果作為卵巢癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量控制方法：嚴(yán)格按照產(chǎn)品的說明書要求進(jìn)行操作，要求質(zhì)控品C1和C2結(jié)果在標(biāo)示范圍內(nèi)；嚴(yán)格執(zhí)行編盲的原則，避免主觀判斷影響產(chǎn)品的檢測結(jié)果；產(chǎn)品檢測過程中，為了避免人為試驗誤差，在產(chǎn)品解盲后，如果研究試劑和金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，要求進(jìn)行重復(fù)測定。

21、,臨床研究觀察指標(biāo) CUT-OFF值匯總正常健康女性樣本的檢測結(jié)果，給出P95結(jié)果作為CUT-OFF值。參考試劑盒提供的CUT-OFF值，對中國健康人群的CUT-OFF值進(jìn)行評價。靈敏度、特異性、總符合率、陽性預(yù)期值和陰性預(yù)期值。臨床療效監(jiān)測將濃度變化和病程發(fā)展匯總到 2x2 表格中，分析HE4在療效跟蹤上的有效性。 臨床試驗中的精密度、重復(fù)性的檢測。,多中心臨床研究,檢測樣本分布,中國人群CUT-OFF值的評價,臨床檢測

22、正常健康人群樣本363例，HE4濃度檢測值范圍為：22.8-106.0pM73.7pM：中國健康人組（P95）的參考值。150pM：試劑盒提供的參考值。,各中心健康人CUT-OFF值的評價,各分中心評價中國健康人群的CUT-OFF值基本一致，可以選擇73.7pM作為中國正常健康人群的參考范圍。,不同的CUT－OFF值對卵巢惡性腫瘤的診斷能力,結(jié)論：以73.7 pM作為CUT-OFF值時，可以大大提高對上皮性卵巢癌病人的診斷

23、率，避免漏檢。 以150 pM作為CUT-OFF值時，HE4在健康人群及良性疾患等對照組中的具高特異性，能有效的鑒別診斷卵巢良、惡性腫瘤，為臨床上皮性卵巢癌的輔助診斷提供有力幫助。,入組患者血清HE4水平分布,說明：在干擾樣本中，提示高膽紅素可能對HE4的檢測有干擾，與國外研究結(jié)果 一致。,HE4在卵巢癌惡性腫瘤中的動態(tài)監(jiān)測的評價,動態(tài)監(jiān)測HE4濃度變化要求：為了避免試劑檢測中存在的偏差，選擇2.5倍的最大

24、精密度(CV)作為HE4濃度變化的指標(biāo)。HE4的陽性變化（陽轉(zhuǎn)）/陰性變化（陰轉(zhuǎn)）為當(dāng)前結(jié)果比前一測試結(jié)果的測定值升高或者降低至少2.5倍最大CV。動態(tài)監(jiān)測樣本： 多中心臨床動態(tài)監(jiān)測評價，共收集34例上皮性卵巢癌患者的64份血清。 32例患者同時收集了術(shù)前、術(shù)后樣本。 2例患者動態(tài)監(jiān)測均為術(shù)后樣本。,HE4濃度變化與病程發(fā)展情況統(tǒng)計,臨床動態(tài)監(jiān)測符合率: 61/64=95.3%，HE4 可以用于上皮性卵巢癌的療效監(jiān)測。,

25、32例患者術(shù)前/術(shù)后HE4濃度變化圖,,備注：HE4濃度變化值=（手術(shù)后HE4濃度-手術(shù)前HE4濃度）/手術(shù)前HE4濃度×100% 其中1-25號為陰轉(zhuǎn)樣本，26-32號為非陰轉(zhuǎn)樣本。,HE4 EIA精密度的評價,三家臨床醫(yī)院測定的3份高、中、低臨床樣本結(jié)果分別進(jìn)行匯總分析每份樣本有30次檢測結(jié)果，分別計算CV值，CV值均低于15%符合臨床試驗方案要求。,HE4在交界性腫瘤的濃度分布,臨床試驗過程中共檢測了10

26、例交界性腫瘤，其中2例HE4濃度分布為150-300pM，3例為73.7-150pM，5例低于73.7pM。,研究結(jié)果,當(dāng)以73.7 pM作為CUT-OFF值時，臨床在進(jìn)行診斷中如果能結(jié)合其它的臨床診斷方法，可以大大提高對上皮性卵巢癌病人的診斷率，避免漏檢，以免貽誤患者的治療。 當(dāng)以150 pM作為CUT-OFF值時，HE4在健康人群及良性疾患等對照組中的具高特異性，能有效的鑒別診斷卵巢良、惡性腫瘤，為臨床上皮性卵巢癌的輔助診斷提供有

27、力幫助。HE4濃度變化與病情發(fā)展間的一致性為95.3% (61/64)，說明HE4 EIA可以用于上皮性卵巢癌的療效監(jiān)測。精密度試驗結(jié)果提示證明試劑盒性能可靠、方法穩(wěn)定。,HE4與CA125血清檢測比較（北京大學(xué)人民醫(yī)院）,總例數(shù) HE4(pmol/L) CA125 (ku/L) P 值

28、 中位數(shù)(范圍) 陽性率 中位數(shù)(范圍) 陽性率 卵巢惡性腫瘤 30 243.8( 27.3~1306.2) 63.3% 601.4(6.2~797.6) 86.7%

29、 0.03 卵巢良性疾病 卵巢良性腫瘤 45 24.7(8~ 65.7) 0 12.0(2.8~735.5) 8.9% 0.058 子宮內(nèi)膜異位 57 38.3(6.5~67.3) 0 5

30、2.9(8.9~ 644.9) 56.1% 0.000 盆腔炎性疾病 8 26.5(11~ 36.7) 0 41.3(6.3~741.6) 62.5% 0.000 健康人 137 32.4(19.4~107.2) 0

31、 11.1(1.4~28.8) 0 /,Allard 在2008年ASCO會議上報道，對80例上皮性卵巢癌患者經(jīng)過治療后監(jiān)測復(fù)發(fā)的434個血清樣本，分別檢測其CA125和HE4，臨床用CT影像學(xué)來判斷腫瘤大小和復(fù)發(fā)。結(jié)果 CA125 或HE4 聯(lián)合應(yīng)用與臨床一致性較高，為 83.8% (67/80)。連續(xù)動態(tài)監(jiān)測臨床符合率： CA125 78.8% (6

32、3/80)； HE4 76.2% (61/80). CA125 不符時, HE4符合率 23.5% (4/17).；HE4 不符時 CA125 符合率 31.6% (6/19). 聯(lián)合 CA125 or HE4 臨床符合率 83.8% (67/80).,1 out of 5 women will be diagnosed with an adnexal mass during their lifetime15 - 10% o

33、f women will have surgery for an ovarian neoplasm 13 - 21% of these masses will be malignant由婦科腫瘤?？漆t(yī)生施行手術(shù)將改善卵巢癌的預(yù)后問題是：How do we identify malignant pelvic masses from benign masses?,術(shù)前確診可改善卵巢癌預(yù)后,Improved survival wi

34、th surgery by ovarian cancer specialists,,Paulsen et al, Int J Gynecol Ca, 2006: 16; 11-17,C- 45,C- 45,TH: Teaching hospitalNTH: Nonteaching hospital,Type of Surgeon Impacts Survival rates,Type of Hospital Impacts Survi

35、val rates,ROMA,,,ROMA value = expPI / [1 + expPI] x 100,Risk of Ovarian Malignancy Algorithm (ROMA) valueEstimate of the risk of ovarian cancer given that the patient had a pelvic mass; their HE4 and CA125 values; and t

36、heir menopausal status,Biomarker and ROMA Scatterplot,,,,,,ROMA Validation trial - Conclusions,At a specificity of 75%, the overall sensitivity for EOC+LMP was 89% Overall sensitivity for EOC was 94%Pre-menopausal wome

37、n 89%Post-menopausal women 95%NPV 94% for EOC+LMP in Pre- and postmenopausal women combinedNPV 97% for EOC17/279 (6%) patients classified as low risk had EOC or LMP9/17 had LMP tumor1 (0.4%) had late stage (III/IV

38、) cancerROMA effectively stratifies patients with pelvic mass into groups with low and high risk of having epithelial ovarian cancer,C- 50,ROMA? vs RMI,Risk of Malignancy Index (RMI)RMI = U x M x serum CA 125 level

39、U= 0 for imaging score of 0= 1 for imaging score of 1= 3 for imaging score of 2-5M= 1 if premenopausal= 3 if postmenopausal,Jacobs I et al. Br J Obstet Gynecol.1990; 97:992-929.,ROMA? has increase

40、d sensitivity compared with RMI,Benign and EOC: All Stages,*Two Sample Test of Equality of Proportions p=0.0129CI: Confidence Interval,ROMA? Has Increased Sensitivity vs RMI For Early Stage Cancer,Benign and EOC: Stage

41、 I & II,*Two Sample Test of Equality of Proportions p=0.0510CI: Confidence Interval,表 患者被ROMA劃分為高危組和低危組的分布,,,,月經(jīng)狀態(tài) 疾病 高危(例 ) 低危(例) 合計(例) 敏感性(%) 特異性(%) PPV (%) NPV (%) 絕經(jīng)后 惡性 35

42、 2 37 EOC 28 0 28 良性 4 8 12 合計a 32 8 40

43、 100.0 66.7 87.5 100.0 合計b 39 10 49 94.6 66.7 89.7 80.0 絕經(jīng)前 惡性 12 4

44、 16 EOC 8 0 8 良性 23 103 126 合計a 31 103 134 100.0

45、 81.7 25.8 100.0 合計b 35 107 142 75.0 81.7 22.9 96.3 全部 惡性 47 6 53

46、 EOC 36 0 36 良性 27 111 138 合計a 63 111 174 100.0 80.4 57.1

47、 100.0 合計b 74 117 191 88.7 80.4 63.5 94.9 a：指EOC與良性腫瘤的合計，b：指惡性腫瘤與良性腫瘤的合計,,,,HE4 Clinical Investigations,ItalyMestre-Venice – P

48、elvic massMilano – Pelvic massBrescia – Endometrial cancerRoma – Ongoing real life studyNorwayOslo – Many biobank studiesSwedenStockholm – Biobank pelvic massBrasilSao Paolo – Ovarian cancerBelgiumLeuven – Pel

49、vic mass,HE4 Clinical Investigations,HE4用于卵巢癌的動態(tài)監(jiān)測和對復(fù)發(fā)的診斷血清HE4與CA125聯(lián)合檢測用于鑒別卵巢癌和卵巢子宮內(nèi)膜異位癥血清HE4 檢測用于子宮內(nèi)膜癌的診斷和隨訪血清HE4用于肺癌的診斷,HE4聯(lián)合CA125鑒別診斷子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢癌,HE4的編碼基因WFDC2主要在卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、子宮內(nèi)膜癌中有表達(dá), 并且在正常的子宮內(nèi)膜腺體中也有表達(dá)，但是在子宮內(nèi)膜異位病灶中是

50、否有表達(dá)尚不明確，,,我們實驗室最檢測了57例卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者血漿中HE4和CA125的濃度。數(shù)據(jù)結(jié)果與49例卵巢癌，60例卵巢良性腫物，50例健康對照作對比，初步探討血清人附睪分泌蛋白4(HE4)和CA125水平檢測在鑒別診斷子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢癌的價值。,,（1）CA125在各組中的中位數(shù) （2）HE4在各組中的中位數(shù),,在子宮內(nèi)膜異位癥中

51、 在卵巢癌中 HE4和CA125無相關(guān)性 HE4和CA125有相關(guān)性,r=0.14P=0.125,r=0.475P<0.05,,卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫以正常為參照 卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫以良性腫物為參照HE4:ROC-AUC<0.5無診斷意義 HE4:ROC-AUC<

52、0.5無診斷意義,,HE4:ROC-AUC =0.453,HE4:ROC-AUC =0.453,,卵巢癌以卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫為參照 HE4:ROC-AUC=0.933,HE4:ROC-AUC=0.933 CA125:ROC-AUC=0.821 HE4+CA125 :ROC-AUC=0.936,,HE4和CA125聯(lián)合診斷CA125可以排除良性卵巢腫物和盆腔子宮內(nèi)膜異位癥，但是不能鑒別卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫和卵巢癌HE

53、4對卵巢癌有高度的敏感性，因此可以將卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫和卵巢癌區(qū)分開,相同特異度下的敏感度,,因此，HE4聯(lián)合CA125可作為子宮內(nèi)膜異位囊腫和卵巢癌的鑒別診斷依據(jù)對超聲顯示有盆腔包塊的患者：HE4和CA125水平同時升高提示卵巢癌可能；CA125升高HE4無明顯升高提示卵巢子宮內(nèi)膜異位可能；,,HE4作為卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥和其他惡性腫瘤的標(biāo)志物，正在臨床發(fā)揮越來越重要的作用。隨著對HE4基礎(chǔ)研究的深入，還有可能在臨床產(chǎn)生更