弓形蟲慢性感染大鼠模型的建立及其在學(xué)習(xí)記憶能力影響研究中的應(yīng)用.pdf

1、弓形蟲病是一種廣泛流行于世界各地且嚴(yán)重危害健康的人獸共患病，病原體弓形蟲具嗜神經(jīng)細(xì)胞性特點(diǎn)，可侵蝕大腦神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致宿主呈現(xiàn)一種慢性、隱匿或潛在的腦部感染。弓形蟲感染宿主非常廣泛，不同宿主對(duì)弓形蟲的易感性不同，并且感染后的癥狀及轉(zhuǎn)歸也不相同。因此選擇適宜的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立弓形蟲感染的動(dòng)物模型，直接關(guān)系到研究工作的成敗，建立慢性感染狀態(tài)的動(dòng)物模型對(duì)人畜弓形蟲病的防治研究也具有極大的實(shí)用價(jià)值。目前，缺乏良好的強(qiáng)毒RH株的慢性感染動(dòng)物模型，已成為

2、當(dāng)前弓形蟲病診斷及疫苗評(píng)價(jià)等相關(guān)研究的重要制約因素之一。大鼠與人相似，對(duì)弓形蟲感染的敏感性低，感染后多呈隱性感染。因此大鼠感染弓形蟲后的動(dòng)物模型更易模擬人類感染弓形蟲后的狀況，對(duì)研究人類感染弓形蟲的免疫學(xué)作用、母嬰傳播以及疫苗的設(shè)計(jì)和診斷試劑的研發(fā)具有更大的價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大鼠弓形蟲感染的研究已有報(bào)道，但大多采用弱毒蟲株如Me49、Fukaya、Pru株等，很少應(yīng)用弓形蟲強(qiáng)毒(RH)株，并且感染后不易分離檢查到弓形蟲病原體而得到確切的

3、感染依據(jù)。
　　 現(xiàn)有研究表明，弓形蟲慢性感染有改變宿主行為的能力，特別是造成宿主的辨別力、學(xué)習(xí)記憶能力等的損害。海馬是記憶形成的關(guān)鍵受損區(qū)，只有海馬或海馬周圍腦區(qū)受損時(shí)，才出現(xiàn)空間定位的記憶障礙。目前關(guān)于弓形蟲感染致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害作用機(jī)制了解較少，需要進(jìn)行深入研究。本研究以清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠為研究對(duì)象，建立慢性弓形蟲感染的大鼠動(dòng)物模型；并應(yīng)用該動(dòng)物模型通過物體識(shí)別試驗(yàn)和Morris’水迷宮觀察弓形蟲慢性感染對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知

4、能力的影響；并研究其海馬組織的細(xì)胞因子、抗氧化水平、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和N-甲基天冬氨酸受體(NMDA)、腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量；腦組織神經(jīng)絲(NF)mRNA表達(dá)、海馬神經(jīng)元細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及其半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt c)表達(dá)及其海馬組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)等，探討其可能的作用機(jī)制。其主要研究?jī)?nèi)容包括：<

5、br>　　 1、弓形蟲慢性感染RH株大鼠模型的建立
　　 通過經(jīng)口或腹腔感染弓形蟲RH株速殖子并輔以免疫抑制方法建立弓形蟲慢性感染的大鼠模型進(jìn)行了比較和研究。結(jié)果顯示口服感染和腹腔感染弓形蟲RH株90天后進(jìn)行解剖，在其腦、肝組織印片、勻漿涂片中均未查見弓形蟲速殖子抑或包囊，用B1基因PCR和B1與529bp基因雙重PCR檢測(cè)腦組織結(jié)果也為陰性，將部分大鼠腦組織勻漿后接種盲傳小鼠，三代后均未出現(xiàn)臨床癥狀，也無死亡。但在免疫抑制后

6、感染弓形蟲RH株組的大鼠腦組織中有2只通過小鼠接種回復(fù)分離成功RH速殖子。同時(shí)在感染弓形蟲速殖子二月后再免疫抑制大鼠腦組織的勻漿涂片中4只發(fā)現(xiàn)查見少量弓形蟲速殖子，并在雙重PCR檢測(cè)中有7只陽(yáng)性。說明通過腹腔接種107弓形蟲RH株速殖子可以建立大鼠的隱性感染模型。
　　 2、慢性弓形蟲感染對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及其海馬細(xì)胞因子和抗氧化水平的影響
　　 通過被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)，觀察弓形蟲感染9周后對(duì)大鼠的學(xué)

7、習(xí)記憶能力等行為學(xué)改變。應(yīng)用放射免疫技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平，同時(shí)以免疫組化檢測(cè)NOS活性。應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性、硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量。結(jié)果顯示慢性弓形蟲感染對(duì)大鼠的記憶獲得沒有影響，但記憶消失要早于對(duì)照組；其Morris水迷宮測(cè)試中逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)，其距離百分比明顯降低(P<0.05)，感染組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；但I(xiàn)L-6水平

8、與對(duì)照組相比差異無顯著性(P>0.05)。感染組大鼠海馬SOD活性較對(duì)照組降低(P<0.05)、海馬MDA含量較對(duì)照組升高(P<0.05)。感染大鼠大腦皮層NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加。提示慢性弓形蟲感染對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有影響，其作用機(jī)制可能與大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子水平升高，自由基清除能力下降，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。
　　 3、慢性弓形蟲感染對(duì)大鼠海馬組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和N-甲基天冬氨酸受體(NM

9、DA)亞單位NR2A、NR2B表達(dá)的影響
　　 將4 w大鼠感染弓形蟲速殖子9 w后，應(yīng)用免疫組化、原位雜交技術(shù)和圖像處理方法分析海馬BDNF，CA1、CA3和齒回狀NR2A和NR2B的表達(dá)。結(jié)果顯示：慢性弓形蟲感染組大鼠免疫組化海馬BDNF陽(yáng)性染色顆粒顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，原位雜交顯示感染大鼠腦組織中BDNF mRNA表達(dá)均增加，海馬陽(yáng)性雜交信號(hào)高于對(duì)照組(P<0.05)。慢性弓形蟲感染組大鼠在CA3區(qū)表達(dá)的免疫反應(yīng)

10、灰度值顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而在CA1區(qū)和齒狀回表達(dá)的免疫反應(yīng)灰度值與對(duì)照組相比較差異無顯著性(P>0.05)。慢性弓形蟲感染組大鼠的NR2B蛋白的表達(dá)在CA1和CA3區(qū)表達(dá)的免疫反應(yīng)灰度值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而在齒狀回表達(dá)的免疫反應(yīng)灰度值差異無顯著性(P>0.05)。提示慢性弓形蟲感染大鼠海馬組織BDNF和BDNF mRNA表達(dá)增強(qiáng)，弓形蟲慢性感染可影響其海馬NMDA受體表達(dá)。
　　 4、慢性弓形蟲

11、感染對(duì)大鼠物體識(shí)別能力和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量的影響
　　 采用物體識(shí)別試驗(yàn)和高效液相色譜電化學(xué)法檢測(cè)弓形蟲感染9周后的大鼠物體識(shí)別能力和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT含量。結(jié)果弓形蟲感染大鼠的物體識(shí)別分辨指數(shù)(DI)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。腦組織中NE、5-HT顯著降低，而DA則顯著升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示慢性弓形蟲感

12、染可能通過影響腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成從而降低物體識(shí)別能力和學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 5、慢性弓形蟲感染對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)絲mRNA表達(dá)和T細(xì)胞免疫水平的影響
　　 將4周齡雄性SD大鼠感染弓形蟲9周后，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠大腦組織中高相對(duì)分子質(zhì)量NF(NF-H)、中相對(duì)分子質(zhì)量NF(NF-M)和低相對(duì)分子質(zhì)量NF(NF-L)mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞；酶聯(lián)免疫吸

13、附試驗(yàn)測(cè)定其血清中γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素4(IL-4)水平。結(jié)果顯示弓形蟲感染大鼠大腦組織NF-L mRNA下降為對(duì)照組的64.56％；NF-M下降為對(duì)照組的95.83％；NF-H下降為對(duì)照組的89.47％。弓形蟲感染組大鼠外周血的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而感染大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-4水平升高。
　　 6、慢性弓形蟲感染對(duì)大鼠海馬神

14、經(jīng)元細(xì)胞周期、凋亡及其半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt c)表達(dá)的影響
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢性弓形蟲感染大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，以羅丹明123染色檢測(cè)其線粒體膜電位，同時(shí)以免疫組化法檢測(cè)海馬caspase-3和Cyt c蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示大鼠弓形蟲感染10周后，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞百分率增高(P<0.05)，即出現(xiàn)G0

15、/G1期阻滯，S期細(xì)胞減少(P<0.05)；線粒體膜電位降低(P<0.05)；caspase-3和Cyt c蛋白表達(dá)則均顯著增高(P<0.05)。提示慢性弓形蟲感染可能導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而引起一定的認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力影響。
　　 7、慢性弓形蟲感染大鼠與正常大鼠海馬的比較蛋白質(zhì)組學(xué)
　　 通過建立慢性弓形蟲感染的大鼠模型，分離大鼠海馬組織并提取海馬蛋白質(zhì)樣品后，通過比較蛋白組學(xué)，分析其差異蛋白。通過基質(zhì)輔助

16、激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行分析。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)檢索，對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)蛋白斑點(diǎn)在慢性弓形蟲感染大鼠海馬蛋白雙向電泳圖譜中消失，11個(gè)蛋白斑點(diǎn)在2組大鼠海馬組織中含量發(fā)生了3倍以上的變化，其中弓形蟲感染組上調(diào)4個(gè)，下調(diào)7個(gè)。質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了16個(gè)差異表達(dá)蛋白，鑒定了9個(gè)蛋白質(zhì)。分別是肌酸激酶、磷酸激酶1、ATP合酶、烯醇化酶、線粒體順烏頭酸酶、谷氨酰合成酶和肌動(dòng)蛋

17、白等，其表達(dá)的差異蛋白功能涉及能量代謝和信號(hào)傳遞等過程。蛋白差異點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為揭示弓形蟲感染致海馬損傷的機(jī)制以及研究弓形蟲慢性感染致學(xué)習(xí)記憶能力影響提供了有益的線索。
　　 8、慢性弓形蟲感染大鼠脊髓組織蛋白質(zhì)的雙向電泳分析和質(zhì)譜鑒定
　　 采用雙向凝膠電泳分離脊髓總蛋白，考染顯色，Image Master圖象分析系統(tǒng)分析，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析獲取肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，Masc

18、ot軟件搜索MSDP、SWISS2PROT數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)。結(jié)果獲得重復(fù)性和分辨率較好的脊髓雙向凝膠電泳圖譜。斑點(diǎn)數(shù)分別檢出268±13和301±15個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)2張電泳圖進(jìn)行匹配后發(fā)現(xiàn)有7個(gè)蛋白斑點(diǎn)在2組大鼠脊髓組織中含量發(fā)生了3倍以上的變化，有差異的7個(gè)蛋白斑點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定的數(shù)據(jù)檢索發(fā)現(xiàn)了3個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。分別為glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(甘油三磷酸脫氫酶)、valosin-co

19、ntaining protein(含纈酪肽蛋白)和cytoplasmic2(Gamma-actin)(類肌動(dòng)蛋白)。弓形蟲慢性感染對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)損傷機(jī)制可能與能量代謝受阻和細(xì)胞增殖有關(guān)。差異蛋白點(diǎn)有可能成為弓形蟲慢性感染的治療靶點(diǎn)。
　　 綜上所述，慢性弓形蟲感染對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定程度的損害，其作用機(jī)制可能是弓形蟲感染后影響了大鼠海馬組織的細(xì)胞因子、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、海馬抗氧化水平以及蛋白差異表達(dá)等。其研究結(jié)果可為發(fā)現(xiàn)