復(fù)方茯苓甘草湯有效成分分離及其防治慢性常壓低氧性肺動脈高壓的實驗研究.pdf

1、[目的] 本實驗以復(fù)方茯苓甘草湯為研究對象，以防治慢性常壓低氧性肺動脈高壓(PAH)的效果為評價指標，建立HP20型大孔吸附樹脂分離復(fù)方茯苓甘草湯水煎液的提取工藝條件，進行復(fù)方茯苓甘草湯水煎液的有效成分(群)/有效部位(群)的提取分離，尋找該方防治慢性PAH的物質(zhì)基礎(chǔ)并進行初步研究，為進一步開發(fā)新的防治慢性PAH的中藥復(fù)方制劑奠定基礎(chǔ)。 [方法] 實驗分藥液組分分離階段、藥液組分篩選階段和動物模型驗證階段三個階段

2、。 1.藥液組分分離階段：用HP20型大孔吸附樹脂分離復(fù)方茯苓甘草湯全方水煎液，分別用蒸餾水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇洗脫，得到相應(yīng)的四部分，揮盡溶劑后以蒸餾水轉(zhuǎn)溶，調(diào)正體積，罐封冷藏，供藥液組分篩選階段和動物模型驗證階段備用。 2.藥液組分篩選階段：64只SPF級Spraque-Dawley系3月齡健康雄性大鼠，體重200-220g，自由進水進食，依據(jù)隨機分配表以及正交設(shè)計方法分為16組，每組4只。采用常壓間

3、斷低氧連續(xù)21天的方法復(fù)制慢性常壓低氧性PAH大鼠模型，每天缺氧8小時。每天缺氧前予相應(yīng)的藥液5ml/只灌胃處理，藥液由藥液組分分離階段來制備，并分別按照正交表配定。檢測大鼠平均肺動脈壓(mPAP)；計算肺滲出指數(shù)(wW/BW)及右心肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]；觀察并計數(shù)每張切片中直徑(50～200)μm的肺血管肌型動脈(MA)、部分肌型動脈(PMA)、無肌型動脈(NMA)的數(shù)目，計算各占肺血管總數(shù)的百分比(即三型肺小動脈所占的比例

4、)；分析肺腺泡內(nèi)直徑(50～200)μm肌型動脈(MA)的圖像，測定管腔面積、中膜面積，計算中膜面積與管腔面積比值(MA/LA)。所得的數(shù)據(jù)依照正交設(shè)計方法進行統(tǒng)計學(xué)分析，繼而篩選出合適的組分。 3.動物模型驗證階段：77只SPF級Spraque-Dawley系3月齡健康雄性大鼠，體重200～220g，自由進水進食，隨機分為7組，每組11只：A組(空白組)、B組(模型組)、C組(蒸餾水洗脫液提取物防治組，簡稱蒸洗液組)、D組(3

5、0％乙醇洗脫液提取物防治組，簡稱30％液組)、E組(60％乙醇洗脫液提取物防治組，簡稱60％液組)、F組(95％乙醇洗脫液提取物防治組，簡稱95％液組)、G組(復(fù)方茯苓甘草湯全方防治組，簡稱全方組)。每天灌以相應(yīng)的藥物5ml/只，其中A組、B組灌生理鹽水，其余各組所用的藥液由藥液組分分離階段來制備。A組不造模，只灌胃，連續(xù)21天；其余各組均采用常壓間斷低氧連續(xù)21天的方法復(fù)制慢性常壓低氧性PAH大鼠模型，每天先灌胃，再缺氧8小時，連續(xù)2

6、1天。檢測指標同藥液組分篩選階段。所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，篩選并驗證合適的組分。 [結(jié)果] 1.藥液組分分離階段，分離得到四種提取物，即蒸餾水洗脫液提取物、30％乙醇洗脫液提取物、60％乙醇洗脫液提取物、95％，乙醇洗脫液提取物，分別簡稱為蒸洗液、30％液、60％液、95％液。 2.藥液組分篩選階段，依實驗證據(jù)分析，結(jié)果如下： 2.1尚不能認為第8組(蒸洗液)與第12組(30％液)對大鼠模型mPAP、R

7、V/(LV+S)、wW/BW和三型肺小動脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P>0.05)，不能使mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW降低。光鏡下見第8、12組大鼠模型肺小動脈的病變情況符合慢性PAH的基本病理特征。 2.2可認為第14組(60％液)與第15組(95％液)對大鼠模型mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW和三型肺小動脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P<0.05或P<0.01)，能使mPAP、RV/

8、(LV+S)、wW/BW、MA(％)、PMA(％)和MA/LA降低，NMA(％)則升高。光鏡下見第15組大鼠模型肺小動脈的病變情況較第8組與第12組減輕，也較第14組顯著好轉(zhuǎn)。 2.3尚不能認為第4組(蒸洗液+30％液)、第6組(蒸洗液+60％液)、第7組(蒸洗液+95％液)、第10組(30％液+60％液)、第11組(30％液+95％液)、第13組(60％液+95％液)這六個組所產(chǎn)生的交互作用，對大鼠模型mPAP、RV/(LV+

9、S)、wW/BW、三型肺小動脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P>0.05)。也即尚不能認為蒸洗液、30％液、60％液、95％液這四種提取液之間的一級交互作用對大鼠模型上述指標有影響。 2.4尚不能認為第2組(蒸洗液+30％液+60％液)、第3組(蒸洗液+30％液+95％液)、第5組(蒸洗液+60％液+95％液)、第9組(30％液+60％液+95％液)這四個組所產(chǎn)生的交互作用，對大鼠模型mPAP、RV/(LV+S)、wW/

10、BW、三型肺小動脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P>0.05)。也即尚不能認為蒸洗液、30％液、60％液、95％液這四種提取液之間的二級交互作用，對大鼠模型上述指標有影響。 3.動物模型驗證階段，依實驗證據(jù)分析，結(jié)果如下： 3.1 B組(模型組)大鼠的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(％)、PMA(％)以及MA/LA比A組(空白組)的均明顯升高，而NMA(％)則明顯降低(P<0.01)。光鏡下見B組

11、肺小動脈病變情況符合慢性PAH的基本病理特征。 3.2 經(jīng)治療后C組(蒸洗液組)、D組(30％液組)的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(％)、PMA(％)以及MA/LA均稍低于B組的，而NMA(％)則稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。光鏡下見這兩組的肺小動脈病變情況基本符合慢性PAH的基本病理特征。 3.3 經(jīng)治療后E組(60％液組)、F組(95％液組)與G組(全方組)的mPAP、RV/(LV+S)

12、、MA/LA均明顯下降(和B組比較P<0.01)；但E組的未能恢復(fù)到A組水平(P<0.01)；而F組與G組的雖稍高于A組的，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)治療后E組、F組與G組的wW/BW均明顯下降(與B組比較P<0.01)，但未能恢復(fù)到A組水平(P<0.01)。經(jīng)治療后E組、F組、G組的MA(％)、PMA(％)均有下降，而NMA(％)則明顯升高(與B組比較P<0.01)。但這三組的MA(％)和E組的PMA(％)均未能降低到A組

13、水平(P<0.01)，而NMA(％)均未能升高到A組水平(P<0.01)。而F組與G組的PMA(％)與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。光鏡下見，經(jīng)治療后E組、F組、G組的肺小動脈的病變情況較B組明顯減輕，總體改善以G組相對最明顯。 [結(jié)論] 1、用HP20型大孔吸附樹脂將復(fù)方茯苓甘草湯全方水煎液分離，可得到相應(yīng)的四種提取液，即蒸餾水沈脫液提取物、30％乙醇洗脫液提取物、60％乙醇洗脫液提取物、95％乙醇洗脫液提

14、取物，分別簡稱為蒸洗液、30％液、60％液、95％液。分離的條件如下：上樣濃度為0.6g生藥·ml-1；按生藥量：樹脂量=1:(1～3)；柱子的徑高比為5cm:25cm，即1:5；吸附流速為(1～5)ml·min-1；靜態(tài)吸附時間30 min；洗脫濃度為蒸餾水、30％、60％、95％乙醇；洗脫劑用量為大約用3倍樹脂體積；洗脫速度為(20～75)滴·min-1即(1～5)ml·min。 2、對慢性常壓缺氧性PAH大鼠模型而言，蒸洗

15、液、30％液、60％液、95％液這四種提取液之間沒有協(xié)同防治作用。 3、對慢性常壓缺氧性PAH大鼠模型而言，蒸洗液、30％液是沒有防治作用的，是復(fù)方茯苓甘草湯全方中的雜質(zhì)部分，可去除；而60％液、95％液是有防治作用的，可以認為它們是復(fù)方茯苓甘草湯防治該大鼠模型的主要的有效成分(群)。也就是說，可以認為復(fù)方茯苓甘草湯防治慢性常壓缺氧性PAH大鼠模型的主要物質(zhì)基礎(chǔ)存在于60％液、95％液這兩種提取液中；95％液較60％液而言，可能