版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、[研究背景]
卵巢癌是婦科常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一,早期病情隱匿,診斷困難,多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期,死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為,易出現(xiàn)盆腹腔內(nèi)廣泛的種植轉(zhuǎn)移,然而對(duì)卵巢癌的發(fā)病及惡性生物學(xué)行為機(jī)制尚不明確。因此揭示卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找新的診斷及治療靶點(diǎn),是目前亟待解決的任務(wù)。
MicroRNAs(miRNAs)是一種長(zhǎng)約22nt的單鏈小分子RNA。廣泛存在于真核生物中,是
2、一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA,可通過(guò)與mRNA分子序列互補(bǔ)相結(jié)合,參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,呈現(xiàn)出組織特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)特征。近年來(lái),隨著生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展和研究手段的進(jìn)步,越來(lái)越多miRNAs分子在各種生物中不斷被揭示,目前已有700多個(gè)miRNAs被發(fā)現(xiàn),調(diào)控機(jī)體內(nèi)1/3以上基因表達(dá),參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程,包括胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與凋亡,造血生成及激素分泌等多種生物學(xué)過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA
3、s參與癌癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),在多種腫瘤組織及細(xì)胞系中檢測(cè)到miRNAs的異常表達(dá),50%以上的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或脆性位點(diǎn),可能通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)某些抑癌基因或癌基因的表達(dá),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要致癌或抑癌的功能。
有研究報(bào)道,miR-21通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN、PDCD4、TPM-I及TIMPs等抑癌基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡。已發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌、肺癌、肝癌等多種癌組織中過(guò)高表達(dá),是
4、實(shí)體腫瘤中最常見(jiàn)的高表達(dá)miRNAs之一,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到一個(gè)癌基因的作用。目前,已相繼有研究證實(shí),在卵巢癌組織、病人血清及外周血小體中檢測(cè)到多種miRNAs的異常表達(dá),其中miR-21不僅在卵巢癌組織中過(guò)高表達(dá),而且在病人血清及外周血小體中也同樣檢測(cè)到miR-21的異常表達(dá),提示miR-21在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有不容忽視的重要地位。但有關(guān)miR-21在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的功能及作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
本
5、研究目的是檢測(cè)miR-21及PTEN在上皮性卵巢癌中的表達(dá),并通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制卵巢癌細(xì)胞系中miR-21的表達(dá),觀察miR-21對(duì)PTEN的影響及miR-21對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的調(diào)控作用。探討miR-21在卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中的作用機(jī)制,為尋找卵巢癌的診斷及治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
第一部分
MiRNA-21及PTEN蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及意義
目的:檢測(cè)上皮
6、性卵巢癌組織中miR-21及PTEN蛋白的表達(dá),分析miR-21異常表達(dá)與PTEN蛋白的相關(guān)性及其與卵巢癌臨床分期、組織分級(jí)、病理類型等特征間的關(guān)系,初步探討miR-21及PTEN在卵巢癌分子發(fā)病中的作用。
方法:采用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(stem-loop real-time RT-PCR)檢測(cè)上皮性卵巢癌組織、良性上皮性卵巢腫瘤及正常卵巢組織標(biāo)本中miR-21表達(dá)。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶(SP)免疫
7、組化方法檢測(cè)上述組織中PTEN蛋白表達(dá)。
結(jié)果:1.miR-21在卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCT)為4.849±1.813,顯著高于良性卵巢腫瘤(1.133±0.291)及正常卵巢組織(P<0.01),在良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織間miR-21表達(dá)量無(wú)明顯差異。
2.miR-21在Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌組織中表達(dá)量為5.603±1.787,明顯高于其在Ⅰ、Ⅱ期組織中表達(dá)3.341±0.254(p<0.01);
8、在低分化卵巢癌組織中表達(dá)量為7.057±1.552,明顯高于其在中高分化癌組織中表達(dá)3.845±0.680(p<0.01);在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)量為7.095±1.728,明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組4.100±1.070(p<0.01);miR-21在漿液性、粘液性及內(nèi)膜樣卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異。
3.PTEN在卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為41.66%,明顯低于卵巢良性腫瘤(83.33%)及正常卵巢(100%);在Ⅲ、Ⅳ
9、卵巢癌組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ、Ⅱ期(25%vs75%,P=0.001);在低分化卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于中高分化(10.71%vs85%,P=0.000);在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PTEN陽(yáng)性表達(dá)率為16.66%,明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移組50.00%(P=0.034)。miR-21及PTEN均與組織病理類型無(wú)關(guān)。
4.相關(guān)分析結(jié)果表明,卵巢癌組織中miR-21表達(dá)量與PTEN陽(yáng)性表達(dá)率存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.447,P<
10、0.01);
結(jié)論:miR-21在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá),且與卵巢癌分期、組織分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的癌基因作用。miR-21與PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),二者可能共同參與卵巢癌的發(fā)病機(jī)制。
第二部分
干擾miR-21表達(dá)對(duì)卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)及生物學(xué)行為的影響研究
目的:擬通過(guò)siRNA干擾卵巢癌細(xì)胞系中miR-21的表達(dá),分析降
11、調(diào)miR-21的表達(dá)后對(duì)卵巢癌細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)及細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響,進(jìn)一步揭示miR-21在卵巢癌分子發(fā)病中的作用機(jī)制。
方法:選用卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3進(jìn)行體外培養(yǎng),采用shRNA表達(dá)載體法,根據(jù)miR-21的兩個(gè)成熟片段,設(shè)計(jì)合成干擾miR-21的siRNA序列,并與表達(dá)載體pSIREN-RetroQ連接重組,合成質(zhì)粒pSIREN-miR-21-1、pSIREN-miR-21-2及pSIREN-m
12、iR-21-Neg,分別轉(zhuǎn)染卵巢癌OVCAR3細(xì)胞系,干擾miR-21在OVCAR3中的表達(dá),同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。采用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(stem-loop real-time RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系中miR-21表達(dá)。Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系中PTEN蛋白表達(dá),應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)方法分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的變化。探討miR-21在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中
13、的可能作用機(jī)制。
結(jié)果:1.Real time RCR結(jié)果顯示pSIREN-miR-21-1和pSIREN-miR-21-2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-21相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCT)為0.26±0.08、0.19±0.06,明顯低于陰性對(duì)照(1.26±0.21)及空白對(duì)照組(1.0±0.19),說(shuō)明兩組干擾質(zhì)粒均具有良好的干擾效果。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后,Western blot檢測(cè)PTEN在pSIREN-miR-21-1和pSIREN-
14、miR-21-2組中表達(dá)明顯上調(diào),pSIREN-miR-21-neg組無(wú)明顯變化。
2.MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活力,顯示在轉(zhuǎn)染pSIREN-miR-21-1和pSIREN-miR-21-2組中,OVCAR3細(xì)胞增殖的抑制率分別為23.9%和29.4%,均明顯高于對(duì)照組(p<0.05,p<0.01),說(shuō)明腫瘤細(xì)胞增殖能力的下降。
4.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)48小時(shí)無(wú)血清培養(yǎng)后,空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染pSIREN-m
15、iR-21-neg組中的劃痕已經(jīng)基本長(zhǎng)滿細(xì)胞,而pSIREN-miR-21-1組中有少量細(xì)胞,但仍可見(jiàn)明顯劃痕。pSIREN-miR-21-2組愈合最差,劃痕中央無(wú)細(xì)胞。提示轉(zhuǎn)染pSIREN-miR-21-1和-2組中細(xì)胞的活能力受到明顯的抑制。
5.Transwell實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染pSIREN-miR-21-1和pSIREN-miR-21-2組中24小時(shí)內(nèi)穿透小室聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)為40±3.56和29.5±2.38,明顯低
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 抑癌基因PTEN、癌基因MDM2在卵巢癌中表達(dá)的研究.pdf
- 卵巢癌PTEN基因失活和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的活化機(jī)制以及與卵巢癌耐藥的關(guān)系.pdf
- 抑癌基因P53和PTEN在卵巢癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf
- mirna-21對(duì)其靶基因pten在前列腺癌中表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究
- miRNA-21在膽囊癌過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制PTEN促進(jìn)細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf
- microRNA-21調(diào)控A549細(xì)胞抑癌基因PTEN的研究.pdf
- PTEN抑癌基因在原發(fā)性腫癌中表達(dá)的初步研究.pdf
- 抑癌基因PDCD4抑制人上皮性卵巢癌惡性行為的研究.pdf
- 宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌基因檢測(cè)
- MicroRNA-21參與上皮性卵巢癌的化療耐藥及其作用機(jī)制.pdf
- GE7導(dǎo)入系統(tǒng)介導(dǎo)抑癌基因NOEY2治療卵巢癌的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 抑癌基因P53突變及多藥耐藥基因表達(dá)在上皮性卵巢癌多藥耐藥機(jī)制中的研究.pdf
- 超聲造影劑介導(dǎo)PTEN基因影響卵巢癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 肝細(xì)胞癌抑癌基因甲基化譜制定及其基因表達(dá)調(diào)節(jié)的表基因機(jī)制研究.pdf
- 扶正抑癌法對(duì)卵巢癌術(shù)后內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)的臨床研究.pdf
- WWOX基因在卵巢癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf
- 抑癌基因pten在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制.pdf
- 癌基因ERBB-2與ER、PR在卵巢癌中的表達(dá).pdf
- 56940.抑癌基因pten在口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌前病變中表達(dá)的研究
- 初、復(fù)發(fā)膀胱尿路上皮癌中miRNA-21和miRNA-205的表達(dá)研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論