類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候分類的系統(tǒng)生物學(xué)基礎(chǔ).pdf

1、本研究首先以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)為例,利用多元統(tǒng)計分析方法,分析了臨床隨機對照試驗的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn):借助因子分析可確定RA的寒熱證候分類,同時寒熱證候分類與中西藥干預(yù)方法的療效相關(guān),且證候的變化也會影響療效的改變,說明中醫(yī)寒熱證候分類在RA治療方法的選擇上具有指導(dǎo)價值。雖然RA寒熱證候分類的依據(jù)主要是中醫(yī)相關(guān)癥狀,但其對療效的影響說明RA寒熱證候具有特定的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 進而,以類

2、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為范例,選取臨床典型的RA寒、熱證患者病例,采用系統(tǒng)生物學(xué)思路與方法(基因組學(xué)及代謝組學(xué)),探索RA寒熱證候的內(nèi)在生物學(xué)特征,期望能豐富中醫(yī)證候理論的科學(xué)內(nèi)涵,同時為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床診斷和有效治療提供理論工具。
　　 1目的
　　 分析RA寒熱證候分類對中西藥治療方法療效的影響,并通過檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎典型寒、熱證CD4+T淋巴細胞基因表達譜及血漿代謝譜,研究寒熱證候的生物學(xué)差異,探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候

3、分類的科學(xué)基礎(chǔ)。
　　 2研究對象和方法
　　 研究思路:利用多元統(tǒng)計分析方法,分析中西藥治療RA隨機對照臨床數(shù)據(jù),探索中醫(yī)寒熱證候分類與療效的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上,隨機選取符合納入標準的RA女性患者,參照相應(yīng)標準進行寒、熱證候辨別。取患者CD4+T淋巴細胞及血漿,進行基因表達譜及代謝組學(xué)測定,尋找類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候之間差異表達的基因及生物標記物,并對結(jié)果進行生物信息學(xué)分析,探尋類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候差異的生物學(xué)基礎(chǔ)。<

4、br>　　 3研究內(nèi)容
　　 3.1臨床數(shù)據(jù)分析
　　 數(shù)據(jù)來源:國家“十五”攻關(guān)項目全國9個臨床中心RA臨床隨機對照試驗數(shù)據(jù)。
　　 分析方法:采用回歸分析、主成分分析、因子分析、辨別分析、聚類分析等多元統(tǒng)計方法,探索RA證候分類及各證候類型與臨床療效的相關(guān)關(guān)系。
　　 3.2實驗研究
　　 基因表達譜研究:隨機選取北京中日友好醫(yī)院女性患者20例,年齡12-68歲。納入病例中寒證患者為10例,

5、熱證患者為10例。
　　 代謝組學(xué)研究:隨機選取北京中日友好醫(yī)院女性患者21例,納入病例中寒證患者為15例,熱證患者為6例；另選取16例女性為正常對照組(依據(jù)體檢結(jié)果排除了感染、炎癥等影響因素)。
　　 ◇病例納入標準:疾病診斷、病情進展分類標準:參照1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ARA)修訂的診斷標準。
　　 ◇證候診斷標準:參照1993年衛(wèi)生部《中藥新藥治療痹病的臨床研究指導(dǎo)原則》、1994年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布

6、的《中醫(yī)病證診斷療效標準·旭痹的診斷依據(jù)、證候分類、療效評定》、1997年中華人民共和國國家標準《中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》和1988年全國中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕類疾病學(xué)術(shù)會議擬訂的診斷標準。
　　 ◇排除標準:合并嚴重關(guān)節(jié)外表現(xiàn),如高熱不退、多發(fā)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、肺間質(zhì)纖維化、腎臟淀粉樣變、縮窄性心包炎、血管炎等需要使用糖皮質(zhì)激素的患者；長期服用有關(guān)治療RA的慢作用藥物,且在本研究前至少1周內(nèi)未停用甲氨喋呤、氯喹、柳氮磺胺吡啶、環(huán)磷酰胺、青

7、霉胺和金制劑等免疫抑制類藥物的患者；合并有循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖、造血系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等嚴重疾病的患者。
　　 4研究方法
　　 4.1基因表達譜研究
　　 ◇CD4+T淋巴細胞分離純化:采集空腹靜脈血,EDTA抗凝,加入CD4+T細胞富集抗體混勻,Ficoll淋巴細胞分離液分離,PBS溶液洗兩遍,離心即可得到純度90％以上的CD4+T淋巴細胞。
　　 ◇芯片雜交前RNA預(yù)處理:按TRIzol說明

8、書,提取細胞總RNA,并進行PNA質(zhì)檢；依據(jù)QIAGEN RNeasy(R)Kit操作手冊純化總RNA；一步法合成cDNA鏈；aaUTP標記合成cRNA；QIAGEN RNeasy Mini Kit純化cRNA并對其質(zhì)控測定；cRNA熒光標記并純化
　　 ◇芯片雜交及檢測:芯片為Agilent人類全基因組芯片(4*44k),所有芯片均以相同對照標記為Cy3,樣本標記為Cy5。cRNA樣品片段化后與芯片雜交,洗滌后Agilent掃

9、描儀掃描得到基因表達譜原始數(shù)據(jù)。
　　 ◇芯片數(shù)據(jù)分析:分析Agilent軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù),取各芯片中位數(shù)比值進行對數(shù)轉(zhuǎn)換,然后用SAS的標準化程序進行均值為0標準差為1的標準化操作；采用SAS的MI Procedure過程對標準化后的數(shù)據(jù)進行缺失值填補；以alpha=0.05為置信度,對缺失值填補后的數(shù)據(jù)進行t檢驗,選擇有顯著性差異的基因；采用SAS的Power Procedure對有顯著性差異的基因過程進行把握度計算,保留Pow

10、er>0.85的基因；以Ratio>2或Ratio<0.5為顯著性差異界限,計算寒熱證差異基因的比值,篩選寒熱差異表達基因。借助BIND、DIP、HPRD、IntAct及MINT等數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析；IPCA運算法則尋找網(wǎng)絡(luò)高聯(lián)接區(qū)并借助BINGO工具對高聯(lián)接區(qū)進行GO功能分析。
　　 4.2代謝組學(xué)研究
　　 ◇血漿處理:EDTA抗凝管收集外周血,離心取血漿凍存?zhèn)溆?。分析前超低溫冰箱取?充

11、分溶解震蕩,加入乙腈高速離心取上清,加入內(nèi)標液充分溶解,離心取上清自動取樣器取樣分析。
　　 ◇樣品檢測:自動加樣器(Agilent7683系列)加到Agilent6890氣相色譜；色譜柱規(guī)格:30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm DB5-MS熔融石英毛細管柱；噴頭溫度設(shè)定為290℃；載氣:氦氣,35cm/秒；柱溫:起始溫度100℃,以2.5℃/min速率增加至285℃,持續(xù)6 min；傳輸器溫度設(shè)定為285℃；傳輸

12、器溫度設(shè)定為285℃；離子源溫度設(shè)定為200℃；數(shù)據(jù)采集范圍m/z40-500；GC/MS(島津)定性分析。
　　 ◇數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)主要采用Par scaling的方法對所有數(shù)據(jù)集的變量進行數(shù)據(jù)尺度同一化處理,采用軟件包(SIMCA-P version11.0)對原始信息進行主成分分析；偏最小二乘法顯著性分析用來找尋能區(qū)分RA寒熱證候貢獻度最大變量。運用質(zhì)譜確定最大貢獻度變量的代謝物結(jié)構(gòu),交叉驗證測試用來確認PLS-DA模型的可

13、靠性。
　　 5結(jié)果
　　 5.1臨床數(shù)據(jù)分析
　　 ◇西藥方案在治療RA寒熱患者過程中,3個月及6個月的療效均以寒證組為高,具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 ◇在患者證候類型變化的情況下,無論中醫(yī)組及西醫(yī)組方案其臨床療效均發(fā)生顯著性改變。
　　 5.2基因表達譜
　　 ◇類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候之間有29個差異基因表達,其中7個基因在寒證高表達:LPAAT-THETA、COL6A1、ENST0000

14、0256367、THC2318696、SPECC1、TLR4、及THC2312748；22個基因在熱證高表達:LOC400509、BF210146、CABLES1、APOA1、CD614215、IGHD、SPP1、WWOX等。
　　 ◇利用ICPA運算法則查找差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)4個高聯(lián)接區(qū),GO功能分析發(fā)現(xiàn)寒證與toll樣受體信號通路有關(guān),而鈣離子信號通路、細胞粘附分子、PPAR信號通路以及脂肪酸代謝途徑

15、與熱證相關(guān)聯(lián)。
　　 ◇生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證患者表現(xiàn)為凋亡及炎癥的不同調(diào)控機制。
　　 5.3代謝組學(xué)
　　 ◇類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者與正常對照組、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候之間均存在代謝物譜差異,PLS-DA得分圖顯示RA與正常對照,RA寒證與熱證之間根據(jù)代謝譜數(shù)據(jù)能夠清晰分開。
　　 ◇PCA、PLS-DA結(jié)合質(zhì)譜方法,找到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候差異的7個潛在生物標記物:3-氧-丙酸(

16、3.Oxy propanoic acid)、L-脯氨酸(L-Proline)、尿素(Urea)、5-氧-脯氨酸(5-Oxo-proline)、核糖醇(Ribitol)、纖維醇(Inositol)、L-亮氨酸(L-Leucine)。其中前6個標記物為熱證上調(diào),L-亮氨酸為寒證上調(diào)。
　　 ◇對這些生物標記物進行功能檢索分析提示:與寒證相比,熱證患者機體存在過多的膠原分解；而寒證患者機體蛋白質(zhì)合成過程大于蛋白質(zhì)分解。
　　

17、6結(jié)論
　　 6.1 RA寒熱證候分類與中西藥臨床干預(yù)方案療效相關(guān),且證候的變化也會影響臨床療效的改變,RA中醫(yī)證候分類在臨床治療方案選擇上具有指導(dǎo)意義。
　　 6.2類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候存在生物學(xué)差異,應(yīng)用基因表達譜方法及代謝組學(xué)技術(shù)能夠檢測出RA寒熱證候差異相關(guān)的基因表達及生物標記物。
　　 6.3生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RA寒熱證候存在對凋亡、蛋白質(zhì)代謝等不同的調(diào)控機制,對這些機制的深入了解可幫助理解不同證候臨