茶枝柑皮多糖提取、分離純化、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究.pdf

1、茶枝柑皮是茶枝柑（Citrus reticulata ‘Chachi’）的成熟果皮，果皮曬干陳化后，便成了廣東道地藥材——廣陳皮。茶枝柑皮主要是藥用（作為廣陳皮）、制成調(diào)味品及涼果，除了含有揮發(fā)油、黃酮外，茶枝柑皮還含有豐富的果膠多糖，歷來(lái)對(duì)茶枝柑皮未進(jìn)行深加工，造成資源的浪費(fèi)。本論文以茶枝柑皮為原料，利用現(xiàn)代分離分析手段，對(duì)茶枝柑皮果膠多糖的提取、純化工藝、單糖組成的測(cè)定方法、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其體外抗氧化活性進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，以期為茶枝柑

2、資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和利用途徑。
　　 1.采用酸水提醇沉法提取茶枝柑皮粗多糖（CCP）。單因素試驗(yàn)確定各因素（提取溶劑pH值、料液比、提取溫度和時(shí)間）對(duì)多糖得率和抗氧化能力影響的合適水平，并用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化。經(jīng)試驗(yàn)得出CCP的最佳提取工藝為：用pH4的酸水、料液比為1：30、提取溫度90℃、提取時(shí)間90min，在此條件下多糖得率和抗氧化FRAP值分別為18.9％和48.9。粗提多糖膨脹力和持水力均較高，并屬于高酯果膠

3、多糖。
　　 2.將CCP通過(guò)樹(shù)脂脫色和Sevag試劑去除蛋白，得到純化的多糖CP。通過(guò)靜態(tài)吸附法，考察了大孔吸附樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂對(duì)CCP溶液的脫色率，由于D-201陰離子交換樹(shù)脂脫色效果優(yōu)于其它樹(shù)脂，故選擇D-201樹(shù)脂作為CCP的脫色樹(shù)脂，并進(jìn)一步研究了D-201樹(shù)脂的最佳脫色工藝：脫色溫度40℃，樹(shù)脂用量8％（m/v），轉(zhuǎn)速75r/min振蕩2h。Sevag法除蛋白則需在反復(fù)萃取6～9次后，達(dá)到蛋白去除率為74％。

4、>　　 3.采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）作為還原醛糖的標(biāo)識(shí)分子，柱前衍生化高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）和普通C18柱，建立了8種常見(jiàn)單糖的快速分析鑒別技術(shù)，并且確定了單糖的衍生化條件及多糖CP的水解條件。CP用2 mol/L的三氟乙酸（TFA）在120℃烘箱中水解2h得到各單糖，單糖在70℃下與PMP衍生化反應(yīng)40min后用1：1（v/v）氯仿渦旋萃取3次。流動(dòng)相20％（v/v）乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（p

5、H 7.1）、流速1.0mL/min、等度洗脫即可實(shí)現(xiàn)單糖的良好分離。方法學(xué)考察結(jié)果表明，各單糖的相關(guān)系數(shù)、精密度、重復(fù)性、回收率均良好。
　　 4.對(duì)純化后的茶枝柑皮多糖CP采用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析進(jìn)行分離得到4個(gè)組分，分別命名為CPN、CPA-1、CPA-2、CPA-3，將CPA-1、CPA-2、CPA-3進(jìn)一步用Sephadex G-100凝膠排阻層析純化得到對(duì)應(yīng)的CPA-Ⅰ、CPA

6、-Ⅱ、CPA-Ⅲ。經(jīng)TSK G-5000PW xL、TSK G-3000PW xL 柱高效凝膠色譜分析，證實(shí)CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ具有較高的純度，其重均分子量分別為8.0×104 Da、2.6×105Da、2.4×105Da。紅外光譜結(jié)果表明，CPN是帶有結(jié)晶水的吡喃多糖，CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ和CPA-Ⅲ均是部分羧酸甲酯化的α-半乳糖醛酸多聚糖。NMR結(jié)果推測(cè)茶枝柑皮多糖主鏈?zhǔn)怯?1→4)-α-GalpA構(gòu)成，存在部分半乳

7、糖醛酸甲酯化，半乳糖、鼠李糖、甘露糖等以α-吡喃糖形式存在于末端或側(cè)鏈。
　　 單糖組成分析表明，CPN中單糖的摩爾比是Man：Rha：GalA：Glc：Gal：Xyl：Ara=0.34：0.07：5.30:1:4.71:0.61:14.7；CPA-Ⅰ的單糖摩爾比是Man：Rib：Rha：GalA：Glc：Gal：Ara=0.12：0.04：0.74：39.33：1：8.48：24.05；CPA-Ⅱ的單糖摩爾比是Man：Rib：

8、Rha：GalA：Glc：Gal：Ara=0.94：0.05：1.33：56.65：1：7.04：19.38；CPA-Ⅲ的單糖摩爾比是Man：Rha：GalA：Glc：Gal：Ara=2.02：1.98：122.66：1：8.85：26.26。
　　 5.通過(guò)體外模擬試驗(yàn)，采用MTT法首先篩選了H2O2致U251細(xì)胞損傷的最佳成模濃度，是0.1875mmol/L；再研究了茶枝柑皮粗多糖（CCP）對(duì)過(guò)氧化氫損傷的U251細(xì)胞的保護(hù)