蛋白酶激活受體對炎癥性腸病中迷走神經(jīng)運動背核的影響以及α-黑素細胞刺激素的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、炎性腸病(IBD)是廣泛影響健康的疾病之一，病理特征是結(jié)腸的粘膜及粘膜下層存在大量的炎癥細胞浸潤，產(chǎn)生大量炎癥因子和趨化因子。這被認為是導致神經(jīng)系統(tǒng)過興奮，出現(xiàn)胃腸道功能紊亂的主要因素之一。 迷走神經(jīng)運動背核區(qū)(DMNV)位于延髓背核，整合著不同來源的外周和中樞信號，通過迷走神經(jīng)提供副交感神經(jīng)信號，調(diào)節(jié)胃腸道活動。DMNV發(fā)出外在神經(jīng)，支配胃腸道功能，而外在神經(jīng)系統(tǒng)在胃腸道功能紊亂與IBD之間的作用尚不清楚。 以往認為，

2、DMNV是控制生命基本的中樞神經(jīng)核團，被嚴密保護且對周圍環(huán)境變化反應不敏感。目前認為IBD產(chǎn)生的炎癥因子可以對DMNV區(qū)有一定的功能；DMNV能夠感受周圍系統(tǒng)環(huán)境的變化而產(chǎn)生反應。DMNV對系統(tǒng)的內(nèi)毒素反應，提示著DMNV本質(zhì)上缺乏血腦屏障的保護，具有腦室周圍組織的特點；DMNV區(qū)發(fā)出神經(jīng)突滲入室管膜層進入第四腦室底部，提示DMNV同時監(jiān)控著血循環(huán)和腦室液的變化；TNBS誘導的大鼠結(jié)腸炎模型也證實血腦屏障的滲透性升高；特異性飽和轉(zhuǎn)運TN

3、F—α和IL-1β進入神經(jīng)系統(tǒng)也得到證實。DMNV在促炎癥因子環(huán)境中，特別在急性腸道炎癥后，可以產(chǎn)生對胃腸道功能的影響。 炎癥介質(zhì)是IBD誘導胃腸道功能紊亂的潛在因素。蛋白酶激活受體(PARs)是G—蛋白配對家族成員，有四個亞型，PAR-1和PAR—3被血栓素激活，PAR—2被胰蛋白酶和類胰蛋白酶激活；PAR—4分別被血栓素和胰蛋白酶激活。PARs存在于許多組織和各種細胞中，與細胞的損傷和炎癥反應相關(guān)。 上皮細胞，腸肌層

4、神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞都證實，PAR-1和PAR—2激活后通過G蛋白介導，激活鈣信號通路，增加細胞內(nèi)鈣離子濃度；在缺乏細胞外鈣離子的也升高。PAR受體特異性激活類似物PARP-1和PARP—2也有相似作用。PARs的N端分開激活受體，是導致受體失敏感的機理。PARs對DMNV的具體功能不清楚。PAR-1存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表明PAR-1在神經(jīng)組織中除了血管再形成作用外，還有其他的生理功能。PAR—2激活被認為是機體在炎癥和過敏狀態(tài)下蛋

5、白激酶的釋放，腸壁內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生。 α—黑素細胞刺激素(α—MSH)除了黑色素細胞合成功能有關(guān)外，還是一種內(nèi)源性的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)肽，具有抗炎性細胞因子的效應及影響能量代謝，是神經(jīng)、免疫與內(nèi)分泌系統(tǒng)之間傳遞信號的一種分子，在基礎研究與臨床治療中都具有重要價值。α—MSH對幾乎所有類型的炎癥都有強大的抑制作用，可通過中樞、外周在多種內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)發(fā)揮作用。小劑量中樞應用α—MSH可抑制外周炎癥介質(zhì)引發(fā)的炎性反應。α黑素細胞刺激

6、素類似物(α—NDP—MSH)延長了α—MSH的作用時間，具有明顯抗炎作用相廣泛用于實驗和臨床中。在中樞神經(jīng)細胞MC4R可以通過激活鈣離子通道和ERK1/2通路磷酸化分別發(fā)揮一定的生理作用。 第一部分炎癥性腸病大鼠模型的建立及蛋白酶激活受體在其結(jié)腸組織中表達 目的：研究TNBS誘導IBD的大鼠模型制備以及了解IBD大鼠的結(jié)腸組織中PAR受體家族存在的情況。 方法：肛門灌注TNBS用7天造模。7天后疾病活動情況的評

7、估；組織學損傷的評估；髓過氧化物酶活性試驗以及實時定量熒光PCR檢測方法。 結(jié)果：實驗7天時兩組體重比較分別為239±17.77克；161.5±5.19克，P<0.05；實驗組體重減少22.9±4.6克；對照組增加60.65±14.63克；實驗期間每日兩組大鼠進食為5.4±2.0克，23.46±4.1克；P<0.01。TNBS—組大鼠DAI評分明顯低于對照組大鼠的平均DAI評分分別為8.8分和0.2分。TNBS實驗組結(jié)腸重量相比

8、對照組，全結(jié)腸毛重量分別為20.74±1.9克，10.32±1.1克；結(jié)腸重量分別為4.849±0.89克，3.2±0.22克距肛門8CM的結(jié)腸重量分別為1.93±0.37克，1.0±0.34克；P<0.05。TNBS組大鼠結(jié)腸炎組織學損傷評分為6.3分，明顯高于對照組的1.3分，P<0.05。實驗組大鼠炎癥腸段的MPO平均活性4.2±0.7U/1cm結(jié)腸；對照組1.08±0.09 U/1cm結(jié)腸；P<0.05。各實驗組大鼠上述兩種PA

9、R-1mRNA，PAR—2 mRNA均顯著上升，分別為317.0±53.86％，354.9±97.48％；相比對照組大鼠的PAR-1 mRNA，PAR—2 mRNA水平為81.25±13.30％；83.50±24.42％，P<0.05。 結(jié)論：TNBS可以制備出IBD大鼠模型。TNBS誘導的IBD大鼠模型的結(jié)腸組織中存在著PAR-1 mRNA和PAR—2 mRNA水平升高，提示著PARs受體的激活在IBD的炎癥過程起著一定的作用

10、。 第二部分 TNBS誘導大鼠炎癥性腸病模型迷走神經(jīng)運動背核區(qū)中病理及蛋白酶激活受體的變化 目的：本研究中通過逆行追蹤技術(shù)研究TNBS誘導IBD大鼠模型后對于DMNV的影響，以及在DMNV神經(jīng)細胞中PAR-1和PAR—2的存在情況。 方法：采用逆行追蹤技術(shù)DiI染色逆行染色DMNV及DMNV片熒光鏡觀察；實時定量熒光PCR比較BD模型DMNV組織中PAR-1 mRNA和PAR—2 mRNA檢測。 結(jié)果：正

11、常組中近AP區(qū)約5.7±1.6/組織切片，IBD組近AP區(qū)約0.5±0.4/組織切片，P<0.01：尾部區(qū)約6.6±1.4/組織切片，IBD組尾部區(qū)約1.4±+0.2/組織切片，P<0.01。IBD的DMNV組織中PAR-1mRNA是正常組織中的1.74±0.32倍，PAR—2mRNA是正常組織中的1.89±0.45倍。 結(jié)論： TNBS誘導的IBD大鼠模型導致DMNV神經(jīng)細胞DiI的染色數(shù)目減少，提示著IBD后DMNV神經(jīng)細胞

12、可能出現(xiàn)一定的病理改變，但改變的意義不知道。在大鼠DMNV組織中存在PAR-1和PAR—2受體。在DMNV神經(jīng)細胞中PAR-1和PAR—2起著一定的激活作用。 第三部分蛋白酶激活受體對炎癥性腸病誘導的神經(jīng)損傷及α—黑素細胞刺激素對IBD誘導神經(jīng)損傷的保護作用 3.1 PAR-1和PAR—2受體激活對于大鼠原代DMNV細胞鈣離子通路影響及作用研究 目的：本研究通過原代DMNV細胞培養(yǎng)后，針對PAR受體發(fā)揮作用的常見

13、的鈣離子通路進行研究，以了解PAR受體激活后作用的途徑和意義 方法：采用大鼠原代DMNV神經(jīng)細胞培養(yǎng)；單細胞熒光染色后鈣離子內(nèi)流測定和ELISA法細胞凋亡和增殖實驗。 結(jié)果：用Thrombin，PAR-1類似物和Trypsin，PAR—2類似物處理大鼠DMNV原代神經(jīng)細胞可激發(fā)細胞鈣離子內(nèi)流。一定劑量范圍內(nèi)激發(fā)細胞鈣離子內(nèi)流的劑量相關(guān)性變化。重復Thrombin和Trypsin處理可激發(fā)細胞鈣離子內(nèi)流，但明顯低于第一次處

14、理后；Thrombin，PAR-1類似物和Trypsin，PAR—2類似物在缺乏細胞外鈣離子時也可激發(fā)細胞鈣離子內(nèi)流；但在預先使用U73122處理后可以明顯降低Thrombin和Trypsin激發(fā)細胞鈣離子內(nèi)流。2APB預處理后可以明顯降低Thrombin，PAR-1類似物和Trypsin，PAR—2類似物激發(fā)細胞鈣離子內(nèi)流的最大值。 ELISA法Thrombin和Trypsin處理濃度升高后原代DMNV細胞出現(xiàn)凋亡比例上升趨

15、勢，且和濃度呈相關(guān)性；增殖被抑制的比例逐漸加重，并與其濃度相關(guān)；壞死比例上升趨勢，且和濃度呈相關(guān)性。 結(jié)論：Thrombin，Trypsin對于原代DMNV細胞的存在導致凋亡壞死和抑制細胞增殖的作用。PAR-1和PAR—2在原代DMNV細胞中可以激發(fā)細胞鈣離子內(nèi)流。 3.2α—黑素細胞刺激素對于原代DMNV細胞鈣離子通路影響以及PAR損傷后的保護作用 目的：本研究以體外培養(yǎng)的大鼠原代DMNV細胞為對象，探討α—M

16、SH有無抑制PAR受體激活后產(chǎn)生的對于DMNV的凋亡作用以及α-MSH的可能抗炎機制。 方法：采用體外大鼠原代DMNV細胞培養(yǎng)以及[Ca2+]i測量：實時熒光定量PCR；Western blotting；ELISA細胞凋亡實驗；ELISA細胞增殖實驗等方法進行研究。 結(jié)果：正常大鼠DMNV組織中存在MC4R mRNA的表達；α-NDP-MSH可以促進原代DMNV細胞ERK1/2信號通路磷酸化；MC4R激活可以促進原代DM