四硫代鉬酸銨增強(qiáng)順鉑抗食管鱗癌的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：
　　食管癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，其發(fā)生率在全球范圍內(nèi)居第八位，死亡率占第六位。根據(jù)組織學(xué)類型，食管癌主要分為食管鱗癌(esophagealsquamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)。在中國(guó)，食管鱗癌作為主要的組織學(xué)類型其致死性高，預(yù)后差，5年生存率低，并具有明顯的地域分布差異。目前食管鱗癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療、化療等，對(duì)于晚

2、期與轉(zhuǎn)移性的食管鱗癌患者，化療仍然是延長(zhǎng)患者生存期與改善患者預(yù)后最主要的治療手段，但耐藥性和毒性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，因此尋找一種新的有效的預(yù)防、診斷和治療食管鱗癌患者的策略顯得越來(lái)越重要。
　　四硫代鉬酸銨(ammonium tetrathiomolybdate，TM)是人類所必須的微量元素鉬的化合物之一，可以與銅離子、血液中的清蛋白形成高親和力的三元復(fù)合物，能螯合血液中游離的銅離子，降低體內(nèi)銅的含量。在多種腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，

3、TM具有減少血管生成、抑制腫瘤生長(zhǎng)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤壞死等作用。研究表明，TM通過(guò)靶向銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白增強(qiáng)婦科腫瘤（如乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等）對(duì)順鉑的敏感性，減少化療中產(chǎn)生的耐藥性，進(jìn)一步提高其抗腫瘤效果。順鉑是目前臨床上用于治療多種惡性腫瘤最廣泛的一線標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，包括宮頸癌、卵巢癌、頭頸部癌、肺癌、胃腸道癌、乳腺癌、食管癌等。然而，順鉑產(chǎn)生的副作用及神經(jīng)毒性，使其使用劑量與藥效都受到了嚴(yán)重的限制，因而如何降低其治療劑量并增強(qiáng)其抗腫

4、瘤效果以及闡明其耐藥的分子機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　研究表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Signal transducers and activators of transcription3，Stat3)信號(hào)途徑參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并成為腫瘤有效的治療靶點(diǎn)。后來(lái)陸續(xù)的研究顯示，Stat3信號(hào)途徑與多種腫瘤的耐藥關(guān)系密切，該途徑的活化是介導(dǎo)腫瘤耐藥極其重要的信號(hào)途徑之一。是否TM聯(lián)合順鉑發(fā)揮抗腫瘤作用與Stat3信號(hào)途徑

5、的活化有關(guān)？這將成為本課題探討的方向。因此，本課題首先通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、遷移和侵襲相關(guān)實(shí)驗(yàn)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)闡明TM在食管鱗癌中的抗腫瘤作用及其可能的分子機(jī)制;進(jìn)一步探討將TM與順鉑聯(lián)合的協(xié)同抗腫瘤作用及其分子機(jī)制。該研究為TM在未來(lái)臨床上治療食管鱗癌患者奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一部分 四硫代鉬酸銨體外抗食管鱗癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制
　　1.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的TM(0、5、10、20、30、

6、50、80、100、150和200μM)，在不同時(shí)間點(diǎn)（24、48、72和96h）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞(EC1、Eca109、EC9706、TE1)增殖能力的影響。
　　2.采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)不同濃度的TM在48h對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。Hoechst染色檢測(cè)不同濃度的TM在48h對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.細(xì)胞劃痕和Transwell小室檢測(cè)不同濃度的TM對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　4.A

7、ffymetrix基因芯片表達(dá)譜分析TM對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca109轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的影響。Western blot檢測(cè)不同濃度的TM在48h對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期、凋亡和侵襲相關(guān)蛋白水平的表達(dá)變化，同時(shí)驗(yàn)證芯片表達(dá)結(jié)果中關(guān)鍵的非受體酪氨酸激酶c-Abl的表達(dá)變化。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。對(duì)于多個(gè)樣本采用One-way ANOVA分析，兩個(gè)樣本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05

8、表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第二部分 四硫代鉬酸銨通過(guò)抑制Stat3途徑增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性
　　1.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的順鉑（0、0.5、1、2、5、8、10、20和50μg/ml）在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h和96h）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞(EC1、Eca109、EC9706和TE1)增殖能力的影響;以及TM聯(lián)合不同濃度的順鉑（0、1、2、5和10μg/ml）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖活性的影響。
　　2.

9、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell小室分別檢測(cè)TM聯(lián)合順鉑在48h對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡和侵襲能力的影響。
　　3.Western blot檢測(cè)TM聯(lián)合順鉑以及TM、順鉑和IL-6共同處理食管鱗癌細(xì)胞48h，Star3和p-Stat3蛋白表達(dá)水平的變化。并且采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TM/順鉑/IL-6共同處理對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn):皮下接種食管鱗癌細(xì)胞EC9706，設(shè)生理鹽水組、單獨(dú)TM治療組、單獨(dú)順鉑

10、治療組和TM聯(lián)合順鉑治療組，每周2次測(cè)定腫瘤體積，并采用GraphPad Prism6.0軟件匯制腫瘤生長(zhǎng)曲線。當(dāng)測(cè)量結(jié)束后，剝離腫瘤組織，做石蠟包埋組織切片，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)血管生成相關(guān)蛋白VEGF、CD31和ERG的表達(dá)以及總的Stat3、p-Stat3和Ki-67的表達(dá)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，對(duì)于多個(gè)樣本采用One-way ANOVA分析，兩個(gè)樣本采用

11、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.CCK-8結(jié)果表明，不同濃度的TM均能抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖活性，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果越明顯。
　　2.細(xì)胞周期結(jié)果表明，不同濃度的TM均能阻滯食管鱗癌細(xì)胞周期在S期;Western blot結(jié)果顯示，TM顯著下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4與細(xì)胞周期素Cyclin D1、Cyclin A蛋白的表達(dá)水平。

12、　　3.細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，不同濃度的TM均能顯著增加食管鱗癌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)，且TM濃度越大，凋亡細(xì)胞數(shù)越多;進(jìn)一步Hoechst染色結(jié)果顯示，TM能夠誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡。此外，Western blot結(jié)果顯示，TM顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3、p-PARP和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。
　　4.在48h和72h，不同濃度的TM均能顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移;此

13、外，Transwell小室結(jié)果表明，不同濃度的TM能顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。Western blot結(jié)果表明，TM顯著下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)。
　　5.Affymetrix基因芯片表達(dá)譜結(jié)果顯示，TM能夠激活或抑制食管鱗癌Eca109細(xì)胞中多種信號(hào)途徑，其中包括下調(diào)Eca109細(xì)胞中c-Abl基因mRNA的水平;Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)不同濃度的TM均能顯著下調(diào)食管鱗癌細(xì)

14、胞中c-Abl蛋白的表達(dá)。
　　第二部分
　　1.CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的順鉑均能顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖活性，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制效果逐漸增加;TM能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的抑制效果。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與未處理組或單獨(dú)處理組相比，TM聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡;Transwell小室結(jié)果顯示，與未處理組或單獨(dú)處理組相比，TM聯(lián)合順鉑顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　3.W

15、estem blot結(jié)果表明，TM聯(lián)合順鉑顯著下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中p-Star3蛋白的表達(dá)水平，而對(duì)總的Stat3的蛋白表達(dá)無(wú)影響。IL-6能夠逆轉(zhuǎn)TM聯(lián)合順鉑組中食管鱗癌細(xì)胞中p-Stat3蛋白表達(dá)的降低，進(jìn)一步的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-6介導(dǎo)的Stat3的活化能夠逆轉(zhuǎn)TM聯(lián)合順鉑介導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)。
　　4.裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，與生理鹽水組、單獨(dú)TM治療組、單獨(dú)順鉑治療組相比，TM聯(lián)合順鉑治療顯著抑制裸鼠移植

16、瘤的生長(zhǎng)。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，TM聯(lián)合順鉑治療能降低腫瘤組織中血管生成相關(guān)蛋白VEGF、CD31和ERG的表達(dá)水平，并抑制p-Stat3的活化，降低Ki-67的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.TM能引發(fā)食管鱗癌細(xì)胞的增殖抑制、S期阻滯、細(xì)胞凋亡以及遷移和侵襲能力的降低，表明TM可能成為抗食管鱗癌潛在的治療制劑。
　　2.TM能從體內(nèi)外增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤效果，提示TM有望成為臨床上順鉑治療食管鱗癌患者的輔助藥物。