西妥昔單抗聯(lián)合順鉑體內(nèi)外抑瘤作用及其分子機制.pdf

1、隨著分子腫瘤學的發(fā)展，人們在分子水平上對腫瘤的認識日益深入，關(guān)于腫瘤分子靶點治療的研究與應(yīng)用是當前腫瘤治療中一個發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域?；熓悄[瘤治療的三大手段之一，但腫瘤細胞對抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性是導致化療失敗的主要原因。另外，化療的作用機理是依耐腫瘤細胞與正常細胞在生長、修復、死亡的動力學差異，因此此類藥物不可避免地會影響正常細胞，而帶來臨床上多種不良反應(yīng)而限制其應(yīng)用。分子靶點治療是治療介質(zhì)在特異性識別腫瘤細胞或腫瘤基質(zhì)靶點的基礎(chǔ)上抑制、

2、殺傷靶點細胞，如非結(jié)合型單克隆抗體、小分子靶點藥物和基因治療等。分子靶點治療藥物因其具有高選擇性和低毒性，已成為腫瘤治療的又一有力手段。 細胞內(nèi)和細胞間的信號轉(zhuǎn)導是生物體各種生物學行為的基礎(chǔ)，信號通路的異常與腫瘤的關(guān)系十分密切。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor)屬于酪氨酸激酶受體超家族erbB成員之一。許多腫瘤中表皮生長因子表達增強，包括結(jié)腸、頭頸鱗狀上皮細胞癌、胰腺癌、非小細胞

3、肺癌、乳腺癌、腎細胞癌、卵巢癌等。EGFR的表達或功能的改變增強配體產(chǎn)生，增加受體基因轉(zhuǎn)錄或擴增，或受體突變導致其酪氨酸激酶持續(xù)激活，從而致使其下游信號通路的增強，最終導致細胞的轉(zhuǎn)化、增殖和抵抗細胞凋亡、促進生存，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。因此，近年來以EGFR為靶點的藥物的開發(fā)和應(yīng)用已成為研究熱點，并在臨床應(yīng)用中取得巨大的突破。 順鉑是一個應(yīng)用于臨床有三十多年歷史的經(jīng)典化療藥物，被廣泛地應(yīng)用于多種腫瘤的治療，

4、如卵巢癌，大腸癌，非小細胞肺癌等。但其常易引發(fā)耐藥而致預后較差，同時順鉑的毒性反應(yīng)所導致的低耐受性也限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找低毒安全的化療增敏藥物聯(lián)用是提高順鉑臨床應(yīng)用效果的一個重要方向。西妥昔單抗(Cetuximab，IMC-C225)是第一個在全球多個國家獲準上市的特異性靶向EGFR胞外區(qū)的人鼠嵌合型單克隆抗體，已在多種腫瘤的體外和臨床實驗中取得了良好的抑瘤效果，在大腸癌、頭頸腫瘤、非小細胞肺癌等腫瘤的治療中其與化療藥物聯(lián)用顯著

5、地提高的化療療效，而且不良反應(yīng)輕，不增加化療藥物的毒副反應(yīng)，耐受性較好。目前已被美國FDA批準用于晚期的結(jié)直腸癌和化療失敗的復發(fā)性和轉(zhuǎn)移性頭頸腫瘤以及其它惡性腫瘤的輔助治療。但是西妥昔單抗在臨床中的應(yīng)用仍存在盲目性和無選擇性，目前也仍然缺乏確實有效的可預測療效的分子標志物來指導其應(yīng)用。本課題通過研究昔妥西單抗對于鼻咽癌及肺癌細胞株體外和體內(nèi)的順鉑敏感性的影響來探討其是否具有增敏順鉑療效、是否可以逆轉(zhuǎn)對順鉑的耐藥，以及可能的機制，為西妥昔

6、單抗在臨床中的選擇性應(yīng)用提供參考和理論依據(jù)。 一、西妥昔單抗與順鉑聯(lián)合對腫瘤細胞增殖的影響 1.西妥昔單抗單藥對腫瘤細胞增殖的影響我們首先觀察了西妥昔單抗單藥對四株鼻咽癌細胞CNE1、CNE2、SUNE1和HONE1及一對肺癌細胞A549和A549／DDP生長的影響，分別以2.5、5、10、20、40、80、160 μ/ml的西妥昔單抗處理細胞72h后，MTT法檢測其抑制效果，在四株鼻咽癌細胞和肺癌細胞中其抑制率一直低于

7、20％，表明西妥昔單抗單藥對鼻咽癌和肺癌細胞的生長無明顯的抑制作用，且無劑量依耐性。 2.西妥昔單抗聯(lián)合順鉑對腫瘤細胞增殖的影響以低于細胞毒作用濃度的順鉑(0.16 μg／ml)與濃度分別為2.5、5、10、20、40、80、160 μg/ml的西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用，能顯著抑制鼻咽癌細胞增殖并呈劑量依賴性，但在西妥昔單抗?jié)舛冗_20-40 μg／ml時對鼻咽癌細胞增殖的抑制作用達到平臺。在肺癌A549細胞中我們也觀察到了同樣的作用趨

8、勢，但是不同濃度的藥物處理對A549／DDP細胞的增殖影響不明顯。 二、西妥昔單抗對腫瘤細胞的細胞周期分布的影響用100μg/ml的西妥昔單抗處理細胞24h后，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示處理組和對照組細胞周期分布無明顯差別，表明西妥昔單抗單藥對鼻咽癌和肺癌細胞的細胞周期分布無明顯影響。但西妥昔單抗與順鉑聯(lián)用可增加順鉑對細胞周期分布的作用，即增加sub-G1期和G1期的細胞，減少S期細胞的分布。 三、西妥昔單抗對EGF活化

9、的EGFR信號通路的影響EGFR信號通路有三條主要下游信號通路，即ras-raf-MAPKs信號通路；PI3K-AKT信號通路；JAK-STAT3信號通路。ERK、AKT和STAT3分別是這三條信號通路中的關(guān)鍵分子，我們通過檢測p-ERK、p-AKT和p-STAT3的組成性表達水平來判斷這三條通路的活化水平。先用濃度為0.1、1、10、100 μg／ml的西妥昔單抗將細胞處理24小時后，再用10ng EGF刺激15分鐘，經(jīng)Western

10、 blot檢測顯示，EGF可顯著地活化EGFR下游的三條信號通路，但是此活化作用可被西妥昔單抗所抑制，即p-ERK、p-AKT和p-STAT3的表達水平可被西妥昔單抗作用而較對照組減少，且此抑制作用是呈濃度依耐性的增加的，但它們的總蛋白表達水平始終無變化。這表明西妥昔單抗是可以發(fā)揮其與EGFR的配體競爭性結(jié)合EGF從而抑制下游信號通路的活化的。我們在順鉑敏感細胞株和耐藥細胞株中均觀察到了類似的效應(yīng)。 四、西妥昔單抗對DDP活化的

11、EGFR信號通路的影響為了研究兩藥聯(lián)合作用的機制，我們用濃度分別為5、10、20μM的順鉑處理細胞，觀察其對EGFR信號通路活化的影響。Western Blot結(jié)果顯示，在順鉑敏感的細胞株，順鉑可濃度依耐性地上調(diào)EGFR信號通路的活化，使得p-ERK和p-AKT的表達上調(diào)。同樣，我們先用濃度為0.1、1、10、100μg／ml的西妥昔單抗將細胞處理24小時后，再用10 μM DDP刺激后，Western blot檢測p-ERK和p-AK

12、T的表達水平顯示，DDP對EGFR信號通路的活化作用可被西妥昔單抗所抑制，即DDP誘導的p-ERK、p-AKT的上調(diào)表達可被西妥昔單抗抑制，此作用是呈濃度依耐性的增加的，而它們的總蛋白表達水平始終無變化。在順鉑耐藥細胞株中，順鉑并不能明顯刺激活化EGFR下游信號通路，即對p-ERK和p-AKT的表達水平無調(diào)節(jié)作用，且西妥昔單抗對此也無明顯影響。 五、西妥昔單抗對裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的作用為了觀察西妥昔單抗在體內(nèi)對腫瘤細胞生長的影響

13、，我們分別建立了HONE1細胞和A549細胞的裸鼠體內(nèi)抑制瘤模型，分為四組，分別給予不同處理：生理鹽水對照組、西妥昔單抗單藥組、順鉑單藥組和兩藥聯(lián)用組。HONE1細胞和A549細胞裸鼠體內(nèi)實驗均顯示：昔妥西單抗單藥組的腫瘤體積變化與生理鹽水對照組相比無顯著性差異；而順鉑單藥組和兩藥聯(lián)用組腫瘤體積均明顯小于對照組;兩藥聯(lián)用組的腫瘤體積增長較順鉑單藥組慢，具有統(tǒng)計學差異。各處理組治療前后未見藥物毒副反應(yīng)． 免疫組化結(jié)果顯示在HONE

14、1細胞裸鼠移植瘤標本中p-AKT及p-ERK在順鉑單藥處理組中較生理鹽水對照組明顯上調(diào)，而昔妥西單抗組和兩藥聯(lián)用組則無明顯變化；在A549裸鼠移植瘤標本中p-ERK在順鉑單藥處理組中較生理鹽水對照組明顯上調(diào)，而昔妥西單抗組和兩藥聯(lián)用組則無明顯變化，p-AKT在各處理組均為高表達。ERCC1在順鉑單藥處理組中較其他組表達略高。 六、西妥昔單抗對肺癌細胞切除修復交叉互補基因1(ERCC1)表達的影響 七、下調(diào)ERCC1的表達

15、對肺癌細胞的藥物敏感性的影響ERCC1的表達和調(diào)控在A549和A549／DDP細胞中存在差異。我們通過SiRNA干擾的手段來抑制ERCC1的表達，探討去除了ERCC1調(diào)控的影響對于細胞的順鉑敏感性的有無改變。在分別瞬時轉(zhuǎn)染ERCC1的SiRNA48h后，再分別用西妥昔單抗單藥、順鉑單藥及兩藥聯(lián)用處理細胞，經(jīng)MTT檢測藥物的抑制作用。結(jié)果顯示：在A549/DDP細胞，ERCC1的表達被干擾后，兩藥聯(lián)用的效果較在陰性對照組顯著增強，而在轉(zhuǎn)染

16、陰性對照SiRNA的A549／DDP細胞，西妥昔單抗和順鉑聯(lián)用較順鉑單藥處理對細胞的生長抑制作用無明顯差別；扣除ERCC1干擾本身對順鉑敏感性的增強后，兩藥聯(lián)用組的抑制效果仍較順鉑單藥組好。在A549細胞，ERCC1的表達被干擾后，兩藥聯(lián)用的效果較在陰性對照組無顯著差異，且ERCC1干擾本身對A549細胞的順鉑敏感性無明顯影響。 結(jié)論 1.西妥昔單抗單藥對鼻咽癌和肺癌細胞的增殖和細胞周期均無明顯影響，但可顯著增強順鉑對敏

17、感株細胞的增殖的抑制作用，而對肺癌耐藥株細胞的藥物敏感性無明顯影響。 2.順鉑可誘導鼻咽癌和肺癌順鉑敏感細胞株中EGFR信號通路的活化并上調(diào)ERCC1的表達，此活化作用可被西妥昔單抗所抑制；而耐藥株細胞EGFR信號通路的活化和ERCCl的表達不受順鉑和西妥昔單抗的作用的影響。 3.用RNA干擾的方法下調(diào)ERCC1的表達后，西妥昔單抗可提高肺癌耐藥細胞株對順鉑的敏感性。 4.西妥昔單抗可提高順鉑敏感細胞株對順鉑的敏