CYGB在胃癌中表遺傳性表達(dá)沉默的研究.pdf

1、目的：
　　 腫瘤抑制基因的表達(dá)沉默在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,而DNA甲基化是腫瘤抑制基因表達(dá)沉默的主要原因之一。本文探討胃癌細(xì)胞中CYGB基因在mRNA水平的表達(dá)及與DNA甲基化和組蛋白去乙酰化的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 一、細(xì)胞株
　　 人正常胃粘膜上皮永生化細(xì)胞株GES-1和6個胃癌細(xì)胞株(SGC7901,BGC823,MGC803,AGS,MKN45,HGC27)。
　　 二、

2、實時定量RT-PCR
　　 上述7種細(xì)胞株培養(yǎng)收獲后以TRIzol處理并用氯仿一異丙醇提取RNA,用DnaseⅠ去除RNA中的DNA,然后行實時定量RT-PCR檢測CYGB的表達(dá),用2-△△Ct法分析實時定量PCR數(shù)據(jù),以GES-1中的表達(dá)量為相對標(biāo)準(zhǔn),其他6個細(xì)胞株中的表達(dá)量與其比較。
　　 三、甲基化特異性PCR
　　 DNA采取經(jīng)典的有機溶劑法提取,然后行重亞硫酸鈉修飾、純化、回收,回收的DNA用甲基化特異

3、性引物和非甲基化特異性引物分別行甲基化特異性PCR,對PCR結(jié)果進(jìn)行電泳分析,判別每一種細(xì)胞株中CYGB基因啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài),分非甲基化(U)、部分甲基化(P)、高甲基化(M)三種狀態(tài)。
　　 四、藥物干預(yù)實驗
　　 以去甲基化藥物和/或組蛋白去乙?；敢种苿KN45細(xì)胞株進(jìn)行藥物干預(yù),以不加任何一種藥物的HGC27作為對照組,其他應(yīng)用任何一種藥物的為實驗組,完畢提取RNA.并行實時定量RT-PCR檢測CY

4、GB的表達(dá),以無藥物干預(yù)的對照組為相對標(biāo)準(zhǔn),其他實驗組與其比較,用2-△△Ct法分析實時定量PCR數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 1、CYGB基因在6株胃癌細(xì)胞株中均表達(dá)下調(diào),去甲基化藥物和組蛋白去乙?；敢种苿┚烧T導(dǎo)CYGB在HGC27中的表達(dá),二者聯(lián)合時誘導(dǎo)作用更強。
　　 2、CYGB基因啟動子區(qū)的DNA在GES1中為部分甲基化狀態(tài),而在6株胃癌細(xì)胞株中均為高甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)論：