PTEN-AKT介導(dǎo)NEDD4-1調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究.pdf

1、目的: 探討NEDD4-1對(duì)U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PTEN的作用，揭示AKT和FAK通路在NEDD4-1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率影響中的作用，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法: 1.構(gòu)建NEDD4-1shRNA表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后擴(kuò)增。通過(guò)脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NEDD4-1、pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1 shRNA及陰性質(zhì)粒到U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)

2、染效率確定最佳時(shí)間點(diǎn)。分別采用Western Blot、RT-PCR于轉(zhuǎn)染后第48 h檢測(cè)PTEN的蛋白含量及mRNA水平變化。 2.應(yīng)用Western Blot分別檢測(cè)pcDNA3.1-NEDD4-1轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞組、U251細(xì)胞組、pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1 shRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞三組中AKT和FAK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。分別應(yīng)用FAK競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑FRNK和AKT的特異性阻斷劑Ly294002，采用W

3、estern Blot等方法研究，論證AKT、FAK在NEDD4-1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡影響中的作用。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建NEDD4-1的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，與空白對(duì)照組相比，NEDD4-1組PTEN蛋白含量明顯減少(P<0.05)，而PTEN mRNA變化不明顯(P>0.05)，NEDD4-1干擾組PTEN蛋白含量明顯增加(P<0.05)，而PTENmRNA變化不明顯(P>0.05)。 2.應(yīng)用We

4、stern印跡技術(shù)，我們分別檢測(cè)了A(pcDNA3.1-NEDD4-1轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞組)、B(U251細(xì)胞組)、C(NEDD4-1RNAi轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞組)三組中AKT和FAK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。在檢測(cè)的三組細(xì)胞中，AKT與FAK蛋白水平無(wú)明顯差異。與B組細(xì)胞相比，A組細(xì)胞中的AKTSer 473位磷酸化程度呈顯著升高，而在C組細(xì)胞中則該位點(diǎn)磷酸化程度降低。用FAK Try397抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A組細(xì)胞較B組細(xì)胞中的FAK Tyr

5、397位磷酸化程度呈顯著升高，而在C組細(xì)胞中則該位點(diǎn)磷酸化程度降低，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AKT和FAK通路都有可能參與NEDD4-1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡作用的調(diào)控。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)我們利用轉(zhuǎn)染FAK抑制劑FRNK質(zhì)粒來(lái)抑制FAK蛋白的磷酸化水平，顯示U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEDD4-1小干擾質(zhì)粒后再轉(zhuǎn)染FRNK質(zhì)粒24小時(shí)后FAK蛋白磷酸化幾乎消失，但NEDD4-1抗凋亡能力并沒(méi)有明顯下調(diào)。利用Ly294002降低AKT蛋白的磷酸化水平后顯示，轉(zhuǎn)染p

6、cDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的兩組細(xì)胞.AKT蛋白磷酸化幾乎消失，并導(dǎo)致了caspase3的激活，但這兩組細(xì)胞的凋亡率并沒(méi)有因?yàn)槭欠褶D(zhuǎn)染NEDD4-1質(zhì)粒而有明顯差異，與此形成鮮明對(duì)比的是未經(jīng)Ly294002處理的兩組U251細(xì)胞(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的兩組細(xì)胞)的凋亡率卻有明顯差異。 結(jié)論: 1.腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NEDD4-1的異常高表達(dá)可通過(guò)翻譯后過(guò)程阻抑PTEN表達(dá)。