洛美沙星和阿莫西林多克隆抗體的制備及Ci-ELISA檢測(cè)方法的初步研究.pdf

1、洛美沙星(LMF)和阿莫西林(AMX)分別屬于氟喹諾酮類和p-內(nèi)酰胺類抗生素，目前在臨床獸藥上應(yīng)用十分廣泛。二者在畜禽食品中的殘留都會(huì)引起一系列后果，例如誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生、敏感人群產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)等。因此，針對(duì)二者殘留的快速檢測(cè)方法的建立對(duì)控制動(dòng)物性食品的衛(wèi)生質(zhì)量、保障消費(fèi)者健康等方面都具有比較重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。 本研究旨在建立畜禽產(chǎn)品中洛美沙星和阿莫西林殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附(Ci-ELISA)檢測(cè)方法。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如

2、下： 1.通過(guò)兩種方法一碳二亞胺法和混合酸酐法分別把洛美沙星與阿莫西林兩種半抗原和載體蛋白牛血清白蛋白與卵清蛋白偶聯(lián)制備免疫原(LMF-BSA,AMX-BSA)和包被原(LMF-OVA,AMX-OVA)。制備的人工抗原經(jīng)紫外掃描和免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明：偶聯(lián)物的紫外吸收光譜明顯具有藥物和載體蛋白疊加的特征；通過(guò)免疫BALB／~小鼠制備抗血清利用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)也證明了免疫原和包被原的成功合成。 2.為了制

3、備較多量的多克隆抗體，分別用LMF-BSA和AMX-BSA作為免疫原免疫新西蘭純種白兔。制備的抗血清分別用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)效價(jià)和特異性，結(jié)果如下：洛美沙星抗血消終點(diǎn)效價(jià)在l：640000以上，并且特異性良好；阿莫兩林抗血清終點(diǎn)效價(jià)在l：64000左右，但是特異性不理想，經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證表明，抗體更多的針對(duì)阿莫西林分解產(chǎn)物，究其原因是因?yàn)槊庖咴瑼MX-BSA在免疫過(guò)程中已發(fā)生部分分解所致。 3.通過(guò)優(yōu)化條件，

4、初步建立了洛美沙星的Ci-ELISA檢測(cè)方法。選取的檢測(cè)優(yōu)化條件為：抗血清稀釋度為1：40000，封閉液為l％的酪蛋白溶液，包被原LMF-OVA的稀釋度為1：1000，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG(HRP-IgG)稀釋度為l：10000。檢測(cè)結(jié)果如下：回歸線性方程為y=-0.2865x+0.3689，相關(guān)系數(shù)R=0.9962(其中y為B／Bo，x為lg[LMF])，線性范圍在0.05gg／ml-5~tg／ml之間，檢測(cè)限為0．024Bg

5、／ml。高低中二個(gè)濃度的批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值分別為17．7％和23．2％，牛奶樣品中的回收率在85％一120％之間。 4．本實(shí)驗(yàn)對(duì)洛美沙星殘留的的高效液相檢測(cè)方法也作了一定的研究，建立了標(biāo)準(zhǔn)品和牛奶樣品中洛美沙星的HPLC測(cè)定方法，結(jié)果如下：對(duì)洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品求得的回歸方程為：H=7．0763c-0.3918(H表示峰高，c表示濃度)，R=0.9999，線性范圍為：O.1μg／ml一100μg／ml，檢測(cè)限為O.062μ

6、g／ml(S／N=3)；對(duì)牛奶樣品用甲醇作處理后進(jìn)樣檢測(cè)，求得的回歸方程為：H=5.0733c+0.3207，R=0.9999，線性范圍為0.1μg／ml-200μg／ml，檢測(cè)限為0.21μg／ml(S／N=3)，提取回收率在70％-80％。以HPLC為標(biāo)準(zhǔn)參比方法驗(yàn)證Ci-ELISA方法的可靠性，求得的回歸方程為：Y=0.9985X+0.0202，相關(guān)系數(shù)R=0.9896(n=11)，表明兩種方法相關(guān)性良好，Ci-ELISA法可實(shí)際