倍他米松多克隆抗體的制備及其ELISA分析方法的建立.pdf

1、倍他米松是一種腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，有較強(qiáng)抗炎、抗過(guò)敏和抗休克的功效。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，由于倍他米松可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，因此得到了廣泛的應(yīng)用，進(jìn)而為畜產(chǎn)品加工的安全問(wèn)題產(chǎn)生不良影響。人體通過(guò)動(dòng)物性食品攝入過(guò)量的倍他米松可導(dǎo)致代謝紊亂、血壓增高、骨質(zhì)疏松等，可能會(huì)給兒童的正常生長(zhǎng)帶來(lái)較嚴(yán)重的不利后果。因此建立動(dòng)物性食品中倍他米松快速檢測(cè)法有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用生物化學(xué)基本理論合成免疫原，免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體，建立ELISA分

2、析方法，并且對(duì)方法的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性等進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并通過(guò)HPLC方法進(jìn)行了確證，具體研究結(jié)果如下:
　　倍他米松抗體的制備:倍他米松(BET)與琥珀酸酐進(jìn)行反應(yīng)，后采用活化酯法與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備免疫原、與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備包被原，通過(guò)紫外掃描和SDS-PAGE法判定偶聯(lián)取得成功;免疫動(dòng)物獲得抗血清，經(jīng)ProteinA-Sepharose4B方法對(duì)抗血清進(jìn)行純化得到多克隆抗體;間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定其滴度為

3、102400、IC15為6.60×10-5ng/mL和IC50為0.97ng/mL。
　　ELISA方法的建立及其穩(wěn)定性的驗(yàn)證:通過(guò)對(duì)抗原抗體反應(yīng)濃度、緩沖鹽濃度、pH值、酶標(biāo)抗體的濃度等條件進(jìn)行分析，確定了建立ELSIA分析方法的試驗(yàn)條件為:包被抗原及抗體工作濃度分別為10μg/mL、純化抗體稀釋倍數(shù)為12800倍，緩沖鹽溶液的pH值為7.5，甲醇濃度范圍是0％～20％，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗兔的使用濃度為稀釋2500倍;板間變異

4、系數(shù)范圍為6.77％～28.01％，變異系數(shù)隨倍他米松濃度的增大而減小，但平均變異系數(shù)為14.27％，在允許范圍內(nèi)，說(shuō)明其穩(wěn)定性較好。
　　抗體特異性驗(yàn)證:選取倍他米松結(jié)構(gòu)類似物地塞米松、氫化可的松、醋酸氟輕松做交叉反應(yīng)，其交叉反應(yīng)率依次是2.51％、4.16％和0.25％。
　　樣品基質(zhì)影響的消除:在樣品基質(zhì)影響消除試驗(yàn)中，采用直接稀釋法;針對(duì)豬肉、牛肉等肌肉樣本和牛奶樣本，經(jīng)簡(jiǎn)單提取離心后，上清液用PBS緩沖液20倍稀釋

5、，即可消除基質(zhì)的影響;針對(duì)肝臟樣本的基質(zhì)，上清液用PBS緩沖液40倍稀釋，即可降低色素的影響，消除基質(zhì)的干擾。提取液稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比，吻合程度高。
　　方法確證性試驗(yàn):本試驗(yàn)以中國(guó)藥典所采用的方法為基礎(chǔ)，建立了分離檢測(cè)倍他米松的高效液相色譜法;在一定的狀態(tài)下對(duì)豬肉、牛肉以及蝦肉等實(shí)行加標(biāo)回收測(cè)試，結(jié)果各組分回收率分別在72.73％～93.06％之間，ELISA檢測(cè)結(jié)果與HPLC檢測(cè)結(jié)果有較好的相關(guān)性y=1.033x