血清脂蛋白膽固醇準(zhǔn)確測定方法研究.pdf

1、準(zhǔn)確測定血清脂蛋白膽固醇需首先分離各種脂蛋白。超速離心法是各種脂蛋白的定義方法，同時也是最可靠的脂蛋白分離方法。用超速離心法可以將各種脂蛋白和亞類大致分為高密度脂蛋白(HDL，密度1.063-1.12g/mL)、HDL2(1.063-1.125)、HDL3(1.125-1.21)、低密度脂蛋白(LDL，1.006-1.063)、小而密LDL(LDLb，1.044-1.063)、大而輕LDL(LDLa，1.006-1.044)、中間密度脂

2、蛋白(IDL，1.006-1.019)、和一種特殊的脂蛋白(a)[Lp(a)，(1.05-1.11)]。在目前的臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，IDL和Lp(a)包括在LDL中。由于Lp(a)在HDL和LDL中均有分布，所以用超速離心分離各種脂蛋白及亞類必須首先消除Lp(a)的影響。 Lp(a)由一分子類似于LDL的脂蛋白顆粒和載脂蛋白(apo)(a)組成，apo(a)與LDL顆粒中的apoB以二硫鍵相連接，少量Lp(a)還與其他脂蛋白(主要為含

3、apoB的β-脂蛋白)以非共價鍵結(jié)合。本研究選擇用β-巰基乙醇(ME)解離Lp(a)，對ME的濃度、ME解離Lp(a)的有效性、Lp(a)解離對HDL穩(wěn)定性的影響、脯氨酸的作用等進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)0.05mol/LME可以使Lp(a)解離為不含apo(a)的Lp(a)[Lp(a-)]和apo(a)，0.1mol/L脯氨酸可有效消除Lp(a)與其他脂蛋白之間的非共價鍵結(jié)合；解離后的Lp(a-)與LDL密度相近，從而實(shí)現(xiàn)HDL的超速離心分離及H

4、DL和LDL包括IDL和Lp(a)]的測定。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，解離后Lp(a-)的密度<1.040，與解離前(1.05-1.11)存在明顯的密度分界區(qū)域，LDLa和LDLb的密度分界點(diǎn)1.044恰好在此區(qū)域，這一特點(diǎn)不僅使超速離心分離測定Lp(a)成為可能，而且還可以分離測定LDLa和LDLb。 各種脂蛋白及其亞類膽固醇測定需要精密的膽固醇分析方法。本試驗(yàn)選用市售豆甾醇作內(nèi)標(biāo)，用Jones反應(yīng)氧化膽固醇和內(nèi)標(biāo)為膽甾/豆甾-4-烯

5、-3,6-二酮，以提高膽固醇和內(nèi)標(biāo)的可分離性及檢測靈敏度。所建方法易操作，靈敏度、精密度好，適用于超速離心后脂蛋白組分中低水平膽固醇測定。 超速離心高效液相色譜(HPLC)準(zhǔn)確測定血清脂蛋白膽固醇的方法如下：血清與含脯氨酸的溴化鈉溶液混合，使背景密度為1.006，超速離心分離底部組分(BF)HDL和LDL (BF1.006)；使背景密度為1.044，超速離心分離LDLb、Lp(a)和HDL(BF1.044)。血清與含ME和脯氨酸

6、的溴化鈉溶液混合，使背景密度為1.044，超速離心分離LDLb和HDL(BF1.044ME)：背景密度為1.063，超速離心分離HDL(BF1.063ME)使背景密度為1.125，超速離心分離HDL3(BF1.125ME)。不同密度和條件超速離心后的底部組分膽固醇(BFC)測定用HPLC法，計(jì)算各脂蛋白組分膽固醇。 HDLC=BF1.063MECLDLC=BF1.006C-BF1.063MECLDLaC=BF1.006C-BF1.044

7、CLDLbC=BF1.044MEC-BF1.063MECHDL2C=BF1.063MEC-BF1.125MECHDL3C=BF1.125MECLp(a)-C=BF1.044C-BF1.044MEC超速離心HPLC法測定血清超速離心底部組分膽固醇(HDLC+LDLC)的結(jié)果與美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)的β-定量法高度相關(guān)(r=0.998)；測定HDLC結(jié)果與CDC指定比對方法(DCM)高度相關(guān)(r=0.998)。本法測定HDLC和L

8、DLC的總CV分別為0.96％~2.07％和0.65％-1.12％；測定HDL2C、HDL3C、LDLaC和LDLbC的總CV分別為0.85-2.66％，0.87-3.21％，0.86-1.11％，和2.59-6.35％。Lp(a)-C測定的總CV為4.42-12.29％。 為了降低Lp(a)-C的測定誤差，提高靈敏度，設(shè)計(jì)了兩次超速離心直接分離和測定Lp(a)-C的方法。血清溶液在脯氨酸存在下1.044的背景密度超速離心，>9

9、5％的Lp(a)分布在離心管的底部；用含ME的密度液將BF調(diào)節(jié)密度至1.040，再次超速離心，則解離后的Lp(a-)分布在頂部組分，HPLC測定頂部組分膽固醇即為Lp(a)-C。兩次超速離心的方法提高了Lp(a)-C測定的靈敏度和特異性，測定Lp(a)-C的總CV為2.85-4.29％。 綜上所述，本研究通過研究Lp(a)的解離和解離前后的密度分布建立了血清主要脂蛋白及其亞類膽固醇的測定方法。本方法有以下特點(diǎn)：(1)首次用超速離

10、心分離包括脂蛋白亞類和Lp(a)在內(nèi)的多種脂蛋白組分，所分離的脂蛋白與應(yīng)用最廣泛的脂蛋白定義一致；(2)物理方法分離脂蛋白，樣品處理過程中的脂蛋白膽固醇變化減至最低程度；(3)統(tǒng)一用膽固醇代表各脂蛋白水平，可使各脂蛋白[包括Lp(a)]和亞類進(jìn)行直接對比；(4)所需樣品量小，0.5mL血清可以測定7項(xiàng)主要脂蛋白組分，一次最多可分析20個樣品；(5)樣品制備簡單、方法易操作，精密度良好。本方法具有良好的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，有望作為HDL、LD