大劑量GC對(duì)PVN神經(jīng)元合成CRH的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)作為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)最上級(jí)的激素，啟動(dòng)了HPA軸對(duì)應(yīng)激原的應(yīng)答；同時(shí)，CRH也參與了交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的活化。因此，一般認(rèn)為CRH是應(yīng)激過(guò)程中最重要的始動(dòng)因子之一，CRH分泌增加可作為反映機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)的客觀指標(biāo)。 傳統(tǒng)認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素(GC)與其胞漿受體(iGR)結(jié)合后，可通過(guò)直接或間接方式抑制CRH的表達(dá)。因此，大劑量GC應(yīng)對(duì)CRH具有非常強(qiáng)烈的負(fù)反饋抑制作用。 但

2、是，有研究顯示，大劑量(≥10-6mol/L)GC并不能完全抑制下丘腦CRH的生成，下丘腦仍可有明顯的CRH的合成與分泌。提示GC在CRH合成與分泌過(guò)程中可能還有更為復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制存在。另一方面，此時(shí)血液GC濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出iGR結(jié)合飽合濃度(高出上千倍)，提示這些現(xiàn)象可能是通過(guò)經(jīng)典的GR以外的途徑發(fā)揮作用的，而與新近認(rèn)識(shí)到的GC膜受體(mGR)可能有密切關(guān)系。因此，我們推測(cè)大劑量GC可能通過(guò)其細(xì)胞膜上受體mGR對(duì)下丘腦的CRH合成與

3、分泌具有一定的調(diào)節(jié)作用。 研究目的 本研究旨在通過(guò)(1)觀察大劑量GC對(duì)下丘腦CRH轉(zhuǎn)錄與合成的影響及規(guī)律，(2)尋找大劑量GC對(duì)下丘腦CRH轉(zhuǎn)錄與合成的非胞漿受體的可能調(diào)節(jié)途徑與機(jī)制，探討多種病理情況下CRH持續(xù)產(chǎn)生相關(guān)機(jī)制、臨床大劑量GC治療的機(jī)制與功效等，為大劑量GC在嚴(yán)重創(chuàng)傷早期的臨床救治中的應(yīng)用提供新的思路和認(rèn)識(shí)。 主要步聚與方法 1.觀察大劑量GC對(duì)下丘腦室旁核(PVN)神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄和表達(dá)CRH

4、的影響。 觀察了在10-6mol/L地塞米松(DEX)、10-9mol/LDEX以及在糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486干預(yù)條件下，PVN神經(jīng)元CRHmRNA和其蛋白質(zhì)合成的變化，以探討大劑量GC對(duì)PVN神經(jīng)元CRH轉(zhuǎn)錄與合成的影響及規(guī)律。 2.探討大劑量GC對(duì)PVN神經(jīng)元細(xì)胞膜電生理活動(dòng)的作用和影響。 神經(jīng)元大多生理功能的依賴于其細(xì)胞膜電活動(dòng)的改變。因此，在前部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本部分實(shí)驗(yàn)著重對(duì)比觀察和研究了10-6m

5、ol/LDEX、10-9mol/LDEX、以及RU486拮抗條件下對(duì)PVN神經(jīng)元自發(fā)放電的作用和影響，以探討大劑量GC是否可能通過(guò)神經(jīng)元細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn)影響神經(jīng)元功能，研究mGR是否在其中起到作用。 3.研究大劑量GC對(duì)神經(jīng)元鈣離子通道的作用與特點(diǎn)，以及其對(duì)下丘腦PVN神經(jīng)元CRH轉(zhuǎn)錄與合成調(diào)節(jié)和影響。 利用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，對(duì)比研究10-6mol/L的DEX、10-9mol/LDEX、以及在RU486拮抗情況下他

6、們對(duì)PVN神經(jīng)元細(xì)胞膜鈣離子通道的影響；利用激光共聚焦顯微鏡掃描觀察加入DEX后，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化，觀察DEX刺激后PVN神經(jīng)元的CRHmRNA和蛋白量的變化。以探討大劑量GC對(duì)細(xì)胞內(nèi)第二信使Ca2+的調(diào)節(jié)作用、以及胞內(nèi)Ca2+濃度變化對(duì)CRH轉(zhuǎn)錄合成的影響。 主要結(jié)果和結(jié)論 大劑量GC可促進(jìn)PVN神經(jīng)元的CRHmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)。在給予10-6mol/LDEX后20min左右，PVN神經(jīng)元

7、胞漿內(nèi)出現(xiàn)CRHmRNA棕黃色染色陽(yáng)性顆粒；30min左右，PVN神經(jīng)元出現(xiàn)CRH蛋白陽(yáng)性著色的綠色熒光顆粒；60min后可見(jiàn)第三腦室背部的周圍腦組織出現(xiàn)綠色熒光顆粒，90min后大腦皮層區(qū)域也可見(jiàn)到綠色熒光；而10-9mol/LGC(生理劑量)作用后未見(jiàn)PVN神經(jīng)元出現(xiàn)CRH的mRNA和蛋白質(zhì)陽(yáng)性染色。利用RU486預(yù)先拮抗所有GR后，10-6mol/L的DEX不能再促進(jìn)PVN神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄或表達(dá)CRHmRNA和蛋白。 大劑量GC

8、能迅速明顯增強(qiáng)PVN神經(jīng)元細(xì)胞放電。10-6mol/LDEX可使PVN單位放電頻率迅速明顯增強(qiáng)，較正常狀態(tài)下增加90.88±35.94％，而生理劑量GC以及生理鹽水均未能誘導(dǎo)神經(jīng)元單位放電頻率增加。RU486預(yù)處理后，10-6mol/LDEX使PVN神經(jīng)元單位放電增加的作用被顯著抑制。 大劑量GC主要通過(guò)促進(jìn)Ca2+內(nèi)流而影響PVN神經(jīng)元細(xì)胞膜的電活動(dòng)增強(qiáng)，也主要通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度促進(jìn)CRH的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。10-6mol/

9、LDEX可誘導(dǎo)出神經(jīng)元內(nèi)向鈣電流增加，升幅約為60.25±14.91％，并使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。而生理劑量GC均未能誘導(dǎo)上述現(xiàn)象的產(chǎn)生。抑制L-型Ca2+通道后，10-6mol/L的DEX未能使細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的改變，且CRH的mRNA和蛋白合成均明顯抑制。預(yù)先給予RU486可使10-6mol/LDEX的作用被明顯抑制。 綜上所述，提示大劑量GC可通過(guò)PVN神經(jīng)元細(xì)胞膜上的mGR，激活其L-型Ca2+通道，促進(jìn)Ca2+