外源性腐胺對正常大鼠肝腎功能和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景
　　 嚴(yán)重?zé)齻斐傻募毙詣?chuàng)面對于人民生命健康的威脅一直是我們非常關(guān)注的問題。與此同時，隨著社會進(jìn)步和生產(chǎn)力提高，導(dǎo)致人民生活水平提高、壽命延長，相應(yīng)出現(xiàn)的慢性創(chuàng)面如糖尿病足、壓瘡等患者明顯增加。無論是急性創(chuàng)面患者還是慢性創(chuàng)面患者，傷口局部或多或少地都會存在壞死組織及其分解物。而在大面積深度燒傷、嚴(yán)重電擊傷、肢體擠壓傷或嚴(yán)重糖尿病足患者中，機(jī)體會產(chǎn)生更加大量的壞死物質(zhì)。過去人們對創(chuàng)面的認(rèn)識是一個逐步加深的過程。由于創(chuàng)面

2、的存在，導(dǎo)致機(jī)體體液丟失，引起一系列的病理生理變化，所出現(xiàn)的休克等難題得到高度重視。不斷的體液滲出并在局部聚集，造成身體營養(yǎng)的不良、免疫力的下降、微生物良好的生長環(huán)境，因此有關(guān)營養(yǎng)、感染問題也倍受關(guān)注。但創(chuàng)面滲出物、壞死物本身對機(jī)體的影響卻少有提及。組織壞死物除了作為良好的細(xì)菌培養(yǎng)基外，本身是否會對機(jī)體產(chǎn)生影響？產(chǎn)生怎樣的影響？何種成分在起主要作用？這些問題目前尚缺乏明確答案。
　　 擬似局部組織壞死組織引起全身性損害的現(xiàn)象在臨

3、床上常?？梢砸姷?大面積深度燒傷后，機(jī)體會出現(xiàn)SIRS、DIC、甚至MODS。
　　 嚴(yán)重災(zāi)禍（如地震、車禍等）可造成擠壓綜合癥，當(dāng)患者獲救減壓后，有些傷員在醫(yī)療后送的途中就發(fā)生死亡。過去有人指出系大塊肌肉壞死致血鉀升高所致。但有人曾留意到大塊的肌肉壞死并不一定血鉀升高，可死亡照樣發(fā)生。
　　 氣性壞疽病例中，它除了傷口惡臭外，貧血、低蛋白血癥也是常有的伴隨癥狀，如處理不及時，死亡難以避免。
　　 慢性創(chuàng)面伴有組

4、織濕性壞死時，可以出現(xiàn)惡病質(zhì)樣改變（消瘦、貧血、低蛋白血癥、甚至腹水等），在嚴(yán)重糖尿病足患者中，此現(xiàn)象更為常見，更為明顯。
　　 如上所述的現(xiàn)象里，似乎有這樣一條線索擺在我們面前:大量的、充滿異味的壞死組織—吸收入血后—機(jī)體損害—嚴(yán)重時危及生命。
　　 何種壞死物會對機(jī)體產(chǎn)生損害？既往的研究表明，燒傷后機(jī)體可產(chǎn)生“燒傷毒素”，但究其成分，眾說不一:有說是“脂蛋白復(fù)合物(LPC)”、或是變性蛋白，有說是“脂質(zhì)過氧化物(LP

5、O)”，甚至還稱是“中分子物質(zhì)”、內(nèi)毒素。但無論如何，大量的實(shí)驗(yàn)證明上述物質(zhì)都不足以導(dǎo)致迅速的、或難以逆轉(zhuǎn)的生命損害。真正的損害因素尚不得而知。
　　 大家知道，壞死組織在蛋白酶的作用下可水解成氨基酸，再經(jīng)氨基酸脫羧基作用，產(chǎn)生腐胺、尸胺、吲哚等，其中具有明顯生物毒性的物質(zhì)以多胺為主，腐胺與尸胺更是擁有劇烈毒性。目前已知腐胺、尸胺既作為一種腐毒堿存在于腐敗物中（含量以腐胺居多），也作為生物體的正常成分而廣泛存在于細(xì)胞中，微量情況

6、下，對機(jī)體的細(xì)胞增生、分化、修復(fù)起著促進(jìn)作用，但當(dāng)機(jī)體局部組織嚴(yán)重壞死后，伴隨腐胺和尸胺的大量吸收，并在血中超過某種濃度時，會在體內(nèi)扮演著怎樣的角色？是否會引發(fā)體內(nèi)的炎癥介質(zhì)的升高，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合癥的發(fā)生，造成機(jī)體全身性的損害？為探討上述問題，我們分別建立了外源性腐胺、尸胺經(jīng)家兔腹腔吸收模型，并以壞死組織勻漿液、生理鹽水為對照，動態(tài)檢測不同物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體炎癥因子的濃度變化，分析其對機(jī)體炎癥因子影響的異同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滅菌處理后的創(chuàng)面

7、壞死組織勻漿液可引起全身性炎癥反應(yīng)，對機(jī)體炎癥因子的誘導(dǎo)時間早于內(nèi)毒素，并且炎癥因子的高峰值甚于內(nèi)毒素，這強(qiáng)烈提示創(chuàng)面壞死組織分解物中可能隱藏著某種比單純內(nèi)毒素更強(qiáng)的刺激因子。雖然外源性腐胺和尸胺都可引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，且尸胺導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)更強(qiáng)烈。但是腐胺誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)與壞死組織勻漿液所誘導(dǎo)的趨勢較為接近，提示腐胺在壞死組織分解物誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中可能起著更重要的作用。因此鎖定其中的“主要損害物”為腐胺。我們試圖通過對大鼠給予外源性腐胺進(jìn)行

8、干預(yù)，觀察肝、腎等重要臟器生理功能和組織形態(tài)改變、細(xì)胞凋亡情況，了解其對機(jī)體的影響和病理生理改變過程，理清局部壞死與全身損害的關(guān)系，為臨床開展積極有效的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　 研究目的:
　　 1、分別觀察健康SD大鼠在不同濃度的外源性腐胺的干預(yù)下，對肝、腎等重要臟器組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響;
　　 2、觀察健康SD大鼠在不同濃度的外源性腐胺的誘導(dǎo)下，肝、腎細(xì)胞異常凋亡程度和變化規(guī)律;
　　 3

9、、初步了解外源性腐胺作用于機(jī)體的毒性表現(xiàn)和可能的致害濃度閾值范圍，進(jìn)一步揭示局部壞死與全身損害的關(guān)系。
　　 材料和方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物及分組清潔級健康SD大鼠90只，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄不限，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組:正常對照組(N組，n=10)，外源性腐胺注射組(P組，n=80)。其中P組設(shè)50μg·g-1和25μg·g-1兩種腐胺濃度亞組（P1組，n=40

10、;P2組，n=40），各亞組設(shè)腹腔內(nèi)注射(IP)后24h、48h、72h、96h共4個時相點(diǎn)作為機(jī)體肝、腎臟器的觀察時相點(diǎn)。各亞組各時相點(diǎn)均為10只。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法外源性腐胺注射組（P組）大鼠從實(shí)驗(yàn)開始(0h)時分別使用50μg·g-1和25μg·g-1兩種濃度的腐胺混合生理鹽水稀釋液共2ml行大鼠腹腔內(nèi)注射1次。然后于實(shí)驗(yàn)開始后各時相點(diǎn)每一濃度活殺10只，活殺后即開腹心臟采血，同時摘取肝、腎器官并固定組織標(biāo)本。而正常對照

11、組（N組）只于大鼠腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水，注射后24h全部活殺。所有實(shí)驗(yàn)動物分籠喂養(yǎng)，飼料進(jìn)食，活殺前6h禁水、食。
　　 3.檢測指標(biāo)及方法
　　 3.1觀察實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況。實(shí)驗(yàn)期間，連續(xù)觀察并記錄注射后各時間點(diǎn)大鼠的一般情況，包括大鼠活動度、精神狀況、進(jìn)食、尿量、大小便顏色及氣味，眼白及皮毛染色（有無黃疸），死亡率等。
　　 3.2受檢臟器病理變化。摘取肝、腎器官常規(guī)制作病理切片，HE染色后光鏡下觀察肝、

12、腎器官組織形態(tài)學(xué)改變;
　　 3.3生化指標(biāo)檢測。各組各時相點(diǎn)活殺后分別心臟采血2～3.5ml，置于普通干燥試管內(nèi)靜置30分鐘，2500r/min離心15分鐘分離血清，-76℃保存。采用全自動生化分析儀測定血清中Cr、BUN、ALT、AST的含量;
　　 3.4DNA原位末端缺口標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測細(xì)胞凋亡。大鼠肝、腎組織予4％多聚甲醛固定后常規(guī)制作組織切片，按TUNEL試劑盒說明書要求操作，高倍鏡下觀察凋亡陽性

13、細(xì)胞，再通過專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算肝、腎細(xì)胞凋亡率。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 各組數(shù)據(jù)中，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(-x)±s）表示，計(jì)數(shù)資料以百分比(％)表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。本實(shí)驗(yàn)為2×4*4的析因設(shè)計(jì)，計(jì)量資料行完全隨機(jī)分組兩因素析因分析(即two-wayanalysisofvariance)，了解各變量之間的主效應(yīng)和交互作用;各時間組、濃度組之間采用單因素方差分析（One-WayAN

14、OVA），然后用Levene'stest檢驗(yàn)方差是否齊性（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05），如果方差齊則進(jìn)一步對樣本均數(shù)進(jìn)行兩兩比較的LSD檢驗(yàn)，反之，如果方差不齊則采用近似F檢驗(yàn)的Welch方法進(jìn)行方差分析后，Dunnett'sT3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，假設(shè)檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05時差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于計(jì)數(shù)資料2×3格表中出現(xiàn)0，將0調(diào)整為0.5后行PearsonChi-Square檢驗(yàn)方法，當(dāng)p＜0.05時，差異具有

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 (1)P組大鼠注射后出現(xiàn)短暫急性毒性癥狀，其中P1組多數(shù)呈精神抑制改變，P2組多數(shù)呈興奮型改變，P1組和P2組比較，精神狀態(tài)改變存在顯著差異(x2=69.408，p＜0.01);
　　 (2)P組大鼠各亞組各時相點(diǎn)肝、腎病理切片HE染色后在光鏡下見肝、腎組織少部分有輕度的水腫，無明顯的細(xì)胞壞死;
　　 (3)血清生化指標(biāo)提示，與N組比較，Cr、BUN、ALT、AST含量于外

16、源性腐胺注射后24h、48h、72h、96h基本呈不同程度升高。P1和P2兩亞組間不同腐胺濃度進(jìn)行比較，Cr、BUN、AST值均存在顯著差異(F=4.759，P=0.032;F=10.88，P=0.002;F=12.21，P=0.001)，其中:Cr、BUN值P2組＞P1組，AST值P1組＞P2組;P1和P2兩亞組間不同時相點(diǎn)進(jìn)行比較，Cr、BUN、ALT、AST值也均存在顯著差異(F=14.322，P=0.000;F=15.84，P=

17、0.000;F=3.23，P=0.027;F=8.22，P=0.000);Cr、BUN、ALT、AST四項(xiàng)指標(biāo)中P1和P2兩亞組間腐胺濃度和時相點(diǎn)交互效應(yīng)顯著(F=5.314，P=0.003;F=9.441，P=0.000;F=16.582，P=0.000;F=11.811，P=0.000)。與N組比較，實(shí)驗(yàn)組各檢測指標(biāo)值基本于24h后開始升高，72h后升高明顯，其中Cr、BUN、ALT值于96h后達(dá)到峰值(P＜0.05)。
　　

18、 (4)采用TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，P1組肝、腎組織中凋亡細(xì)胞逐漸增多，96h后達(dá)峰值。P1組96h時相點(diǎn)與N組比較，肝細(xì)胞凋亡率明顯升高[(15.29±1.41)％vs(3.50±0.30)％，P＜0.01]，腎細(xì)胞凋亡率也明顯升高[(24.78±2.19)％vs(4.47±0.33)％，P＜0.01];P2組中肝、腎組織中凋亡細(xì)胞于注射后48h即達(dá)到峰值，96h后逐漸回落至正常。P2組48h時相點(diǎn)與N組比較，肝細(xì)胞凋亡率明顯升高[(

19、13.81±1.66)％vs(3.50±0.30)％，P＜0.01]、腎細(xì)胞凋亡率也明顯升高[(26.27±2.13)％vs(4.47±0.33)％，P＜0.01]。
　　 結(jié)論
　　 1一定濃度的外源性腐胺能導(dǎo)致肝、腎等重要臟器功能出現(xiàn)不同程度的損害，但在光鏡下不一定伴有肝、腎組織形態(tài)學(xué)上的明顯異常;
　　 2.外源性腐胺可誘導(dǎo)肝、腎細(xì)胞高凋亡率，凋亡程度與外源性腐胺存在時間-劑量效應(yīng);
　　 3.本實(shí)