高壓氧對正常及SIRS大鼠脾T淋巴細胞的影響.pdf

1、前言：
　　 高壓氧作為一種治療手段,廣泛應(yīng)用于臨床。研究顯示高壓氧促進傷口部位的纖維母細胞、上皮細胞和血管的增生,促進傷口愈合,增強細胞的殺菌能力,對特殊厭氧菌具有致命的殺傷力。在全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome,SIRS)狀態(tài)下,高壓氧的免疫調(diào)節(jié)作用,包括對T細胞的影響以及抗炎作用的研究尚不多見。SIRS從一個新的角度闡明多器官功能障礙綜合征(multiple

2、organ dysfunction syndrome,MODS)的重要病理生理及發(fā)生發(fā)展過程。經(jīng)過20余年的大量實驗研究和臨床資料揭示,創(chuàng)傷、感染、休克發(fā)展到MODS存在著一條共同通路,即SIRS。本實驗以SIRS為基礎(chǔ),以免疫功能和炎癥反應(yīng)中具有代表性的脾T淋巴細胞為研究對象,研究高壓氧對正常機體以及SIRS時細胞免疫功能的影響,并探討其作用機制。
　　 方法：
　　 一、實驗動物與分組
　　 健康雄性SD大鼠

3、50只,購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,體重約140～180g,隨機分為5組,每組10只。A組:腹腔注射等量生理鹽水(5ml/kg);B組:腹腔注射等量生理鹽水(5ml/kg),做3次高壓氧;C組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg);D組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg),做1次高壓氧;E組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg),做3次高壓氧。
　　 二、大鼠SIRS模型建立
　　 將酵

4、母多糖粉劑和無菌液體石蠟混合,高頻振蕩15分鐘,100℃水浴80分鐘滅菌,制成濃度為100 mg/ml的酵母多糖A-石蠟混懸液,存放于4℃?zhèn)溆?臨用前40℃水浴復(fù)溫,高頻振蕩15分鐘后注藥。大鼠實驗前18小時開始禁食,不禁水。C、D、E組以500mg/kg體重給大鼠腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液,A、B組注射等量生理鹽水(5ml/kg)。
　　 三、高壓氧治療方案
　　 做1次高壓氧的時間為腹腔注射后4小時,做3次高壓氧的時

5、間分別為腹腔注射后4小時,10小時,18小時。每次高壓氧都遵循以下方案:100％純氧洗艙5分鐘,以清除艙內(nèi)原有空氣。勻速加壓至2ATA(約10-15分鐘),用已校對的測氧儀測艙內(nèi)氧濃度達95％以上,期間以4L/min的速度持續(xù)通O2避免CO2蓄積,并將壓力維持在2ATA。1小時后以同樣速度勻速減至常壓,出艙。
　　 四、標(biāo)本采集及檢測
　　 腹腔注射24小時后,每只鼠按實驗設(shè)定順序取脾,標(biāo)號,脾臟剪至糊狀,100目篩濾過

6、(加PBS),離心1000rpm10分鐘,棄上清,低滲休克法溶解紅細胞,RPMI1640調(diào)整細胞濃度1×106/ml。(1)取上述液體0.1ml。(2)4℃離心10分鐘,棄上清。(3)加入冷PBS1ml,輕輕震蕩,1000rpm4℃離心10分鐘,棄上清,重復(fù)2次。(4)加200 uL Buffer。(5)加10 uL AnnexinV-FITC。(6)加PI10uL,25℃,15分鐘。(7),加300uLBuffer30分鐘內(nèi)上流式細胞

7、儀測量。
　　 五、統(tǒng)計學(xué)方法
　　 用SPSS13.0 for Windows軟件分析數(shù)據(jù)。各組數(shù)值用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,用F檢驗做方差齊性檢驗,當(dāng)方差齊性相等時,兩組間采用兩獨立樣本t檢驗,方差齊性不等時采用近似t檢驗即t'檢驗。設(shè)P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、大鼠SIRS模型建立效果
　　 一般情況:腹腔注射酵母多糖-石蠟溶液組大鼠呼吸急促,伴有明顯喘鳴,皮膚粘膜發(fā)紺,

8、出汗,毛色灰暗,部分大鼠有鼻出血,腹脹,腹瀉。大鼠進食明顯減少,活動差,對外界刺激無反抗。大體改變:殺鼠后,見SIRS組大鼠腹腔滲出增多,腸管擴張,程度不一;肝臟呈暗紅色或暗紫色;肺臟可見不同程度腫脹,部分可見充血出血點;心臟,腎臟,脾臟,胰腺無明顯大體改變。
　　 二、高壓氧對正常大鼠脾T細胞的影響
　　 B組CD4+T細胞比例同對照組(A組)相比明顯減少(P＜0.01),CD8+T細胞基本無變化,CD3+CD4+/C

9、D3+ CD8+比值明顯下降(P＜0.05)。
　　 三、酵母多糖對脾T細胞的影響
　　 注射酵母多糖的大鼠CD4+和CD8+T細胞均較對照組明顯減少(P＜0.01),減少程度基本平行,所以CD3+CD4十/CD3+CD8+無變化。
　　 四、高壓氧對SIRS大鼠脾T細胞的影響
　　 高壓氧使酵母多糖導(dǎo)致的CD4+T細胞減少明顯恢復(fù)(P＜0.05)。同高壓氧對正常大鼠T細胞的影響一樣,高壓氧幾乎不影響CD

10、8+T細胞,故CD3+ CD4+/CD3+CD8+比值升高(P＜0.05)。
　　 五、一次高壓氧和三次高壓氧對脾T細胞的不同影響
　　 D組和E組的CD4+和CD8+T細胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異。也就是說,三次高壓氧治療對于CD4+T細胞的恢復(fù)并不比一次高壓氧治療具有更好的效果。
　　 結(jié)論：
　　 高壓氧特異性影響CD4+T細胞,對CD8+T細胞幾乎無影響。它可以使正常機體CD4+T細胞明顯減少,對SIRS