Snk-SPAR途徑在大鼠脾淋巴細(xì)胞中的初步研究.pdf

1、T 淋巴細(xì)胞的活化是機(jī)體啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵事件，在T細(xì)胞發(fā)育階段和成熟T細(xì)胞階段，對(duì)T細(xì)胞受體 (T-cell antigen receptor，TCR)表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答起重要作用，進(jìn)而對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育、活化、存活、死亡起關(guān)鍵性作用。最近研究表明，TCR信號(hào)領(lǐng)先于免疫突觸(immunological synapse，IS)的形成，TCR在突觸中央集聚成簇不但促進(jìn) TCR信號(hào)傳遞，而且加強(qiáng)TCR下調(diào)和內(nèi)化的幾率，提出IS

2、是一類自適應(yīng)性控制器，在T細(xì)胞與特異性配體應(yīng)答過程中調(diào)節(jié) TCR信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。Gascoigne亦證實(shí)某些T細(xì)胞信號(hào)領(lǐng)先于IS成熟之前，但T細(xì)胞的充分活化有賴于IS穩(wěn)定持續(xù)的信號(hào)。因此對(duì)免疫突觸調(diào)控的更好的理解將極大的推動(dòng) TCR免疫識(shí)別和T細(xì)胞活化機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 血清誘導(dǎo)激酶(serum-inducible kinase，Snk)是絲氨酸/蘇氨酸特異性馬球樣激酶(polo-like kinases，Plks)家族成員之

3、一，是G1期Plk；樹突棘相關(guān) Rap-特異性 GTPase-活化蛋白(spine-associated Rap guanosinetriphosphatase activating protein，SPALR)位于樹突棘，SPAR以分子橋梁的形式與突觸后表面蛋白，腳手架蛋白和肌動(dòng)蛋白相連，是通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白重排控制樹突棘形態(tài)的多域突觸后蛋白。神經(jīng)元活化能誘Snk表達(dá)，Snk靶向樹突棘，與SPAR上的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)域相結(jié)合使SPAR發(fā)生磷

4、酸化，泛素連接酶識(shí)別磷酸化SPAR后，SPAR即被泛素修飾，隨后SPAR經(jīng)蛋白酶體途徑發(fā)生降解，造成PSD95等腳手架蛋白的丟失，引起樹突棘形態(tài)學(xué)變化即由鈍圓形變成狹長狀，這就形成了Snk觸發(fā)泛素化并進(jìn)而降解SPAR的Snk-SPAR途徑。Snk-SPAR途徑可能對(duì)突觸興奮性提高后的突觸功能緩沖起穩(wěn)念調(diào)節(jié)作用，該途徑能維持局部突觸界面修飾為基礎(chǔ)的突觸可塑化的穩(wěn)定性，能全面調(diào)整神經(jīng)元活化水平，對(duì)Snk-SPAR途徑的調(diào)控將成為控制突觸重構(gòu)

5、的強(qiáng)有力的方法。盡管神經(jīng)突觸和免疫突觸顯著不同，但二者共享許多相似的特性，神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)通過突觸在構(gòu)成它們瞧兩個(gè)細(xì)胞之間直接傳遞和轉(zhuǎn)換強(qiáng)大的分泌控制信號(hào)，且這種刺激信號(hào)是特異的和保守的；結(jié)構(gòu)上神經(jīng)突觸和免疫突觸都由中央活化區(qū)和富含粘附分子的周邊區(qū)組成，中央?yún)^(qū)具有分泌功能，周邊區(qū)具有內(nèi)吞作用。至今為止神經(jīng)生物學(xué)家和免疫學(xué)家已發(fā)現(xiàn)有些分子為兩者所共有。因此設(shè)想在免疫突觸中或許也存在Snk-SPAR途徑調(diào)控免疫突觸重構(gòu)進(jìn)而影響免疫活化網(wǎng)絡(luò)

6、的可塑性。本文是該設(shè)想的第一步探索．即探討Snk．SPAR途徑是否存在于免疫系統(tǒng)。 本研究選取健康成年SD大鼠(體重為275±25g，雌雄各半)為研究對(duì)象，常規(guī)制備大鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至2×10<'6>/ml。首先用MTT法確定刀豆蛋白A(ConcanavalinA，Con A)激活淋巴細(xì)胞的最適濃度之后，將Con A干預(yù)的脾淋巴細(xì)胞設(shè)為7個(gè)不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(設(shè)空白對(duì)照組)，分別收集各時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞，提取總RNA，用

7、RT-PCR法初步檢測(cè)Snk、SPAR mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況(同時(shí)設(shè)大鼠海馬組織為陽性對(duì)照)。在此基礎(chǔ)上，制備脾CD4<'+>T細(xì)胞，將Con A干預(yù)的CD4<'+>T細(xì)胞設(shè)為0.5h、1h兩個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(設(shè)空白對(duì)照組)，分別收集各時(shí)間點(diǎn)CD4<'+>T細(xì)胞，提取總蛋白，用Dotblot法進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證Snk、SPAR存在于淋巴細(xì)胞中。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.確定刀豆蛋白A的最適活化濃度MTT法確定Con A活化

8、淋巴細(xì)胞的最適劑量為5μg/ml。 2.Snk mRNA在脾淋巴細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)未加Con A的10min對(duì)照組，脾淋巴細(xì)胞中存在Snk mRNA的基礎(chǔ)性表達(dá)；用Con A活化的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Snk mRNA表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化：培養(yǎng)10min時(shí)，Snk條帶清晰，表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，培養(yǎng)達(dá)到0.5h時(shí)，Snk表達(dá)升高且達(dá)到高峰(與其他各組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05)，培養(yǎng)1h，Snk表達(dá)減少，當(dāng)培養(yǎng)2h時(shí)，Snk表

9、達(dá)繼續(xù)下降，培養(yǎng)6h、24h、72h時(shí)Snk表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，與10min對(duì)照組比較已無明顯差異(P>0.05)。 3.SPAR mRNA在脾淋巴細(xì)胞中的動(dòng)念表達(dá)不加Con A的10 min對(duì)照組淋巴細(xì)胞中存在SPAR mRNA的基礎(chǔ)性表達(dá)；在Con A活化的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，SPAR mRNA表達(dá)呈動(dòng)態(tài)改變：培養(yǎng)10 min時(shí)，SPAR條帶清晰(與對(duì)照組無差異，P>0.05)，培養(yǎng)0.5 h時(shí)，SPAR mRNA較10 min

10、時(shí)表達(dá)減少(P<0.05)，培養(yǎng)1 h時(shí)，SPAR mRNA的表達(dá)較0.5 h進(jìn)一步下降并降至低谷，當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到2 h時(shí)，SPAR mRNA較1 h表達(dá)無差異(P>0.05)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，SPAR mRNA表達(dá)上升，培養(yǎng)6h、24h、72h時(shí)SPAR mRNA表達(dá)呈持續(xù)增加態(tài)勢(shì)。 4．Snk、SPAR蛋白在脾CD4<'+>T細(xì)胞中的表達(dá)不加Con A的0.5 h對(duì)照組CD4<'+>T中存在Snk、SPAR蛋白的基礎(chǔ)性表達(dá)；在

11、Con A活化的0.5 h、1 h時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)到CD4<'+>T中存在Snk蛋白的表達(dá)，SPAR蛋白在0.5 h時(shí)有表達(dá)，在1 h未檢測(cè)到。 結(jié)論： 1．正常大鼠脾淋巴細(xì)胞存在Snk mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)。受Con A激活時(shí)Snk mRNA表達(dá)增加，且該表達(dá)在激活早期呈先升后漸趨恢復(fù)到基礎(chǔ)水平的動(dòng)態(tài)變化的過程。 2．正常大鼠脾淋巴細(xì)胞中存在SPAR mRNA的基礎(chǔ)性表達(dá)；在Con A活化的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，SPAR