肺炎支原體感染誘導(dǎo)鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、前言: 肺炎支原體(Mp)感染可引起原發(fā)性非典型肺炎、咽炎、氣管炎、支氣管炎等呼吸道疾病，嚴(yán)重者可引起復(fù)雜的肺外合并癥和致死性肺炎。其感染不僅發(fā)病率較高，且病程長(zhǎng)，易復(fù)發(fā)。肺炎支原體感染的發(fā)病機(jī)理至今并未清楚，主要觀點(diǎn)趨向于肺炎支原體直接侵入呼吸道上皮細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)和感染導(dǎo)致免疫紊亂反應(yīng)兩種學(xué)說。近幾年來，有不少研究者通過對(duì)數(shù)例臨床支原體肺炎患兒外周血檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患兒存在外周血淋巴細(xì)胞凋亡增強(qiáng)現(xiàn)象，且外周血淋巴細(xì)胞凋亡率與CD4

2、+細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+細(xì)胞比值呈明顯負(fù)相關(guān)。研究報(bào)道外周血成熟淋巴細(xì)胞凋亡加速可能是引起該組患者免疫功能降低、病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)的一個(gè)重要原因。那么，Mp能否體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，Mp感染與CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系如何，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過用不同濃度的Mp感染體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞，用PE-Cy5 Rat anti-Mouse CD4標(biāo)記CD4+T淋巴細(xì)胞，采用AO/EB熒光染色技術(shù)和Annexin-V FITC/P

3、I流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)總淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)亡情況，對(duì)Mp誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡進(jìn)行探討，為進(jìn)一步闡明肺炎支原體感染的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法: 一、肺炎支原體的培養(yǎng) 將本實(shí)驗(yàn)室保存的肺炎支原體菌株復(fù)蘇后接種于支原體液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察到有支原體生長(zhǎng)即作傳代培養(yǎng)。 二、淋巴細(xì)胞獲取 選用體重為20克左右的昆明小鼠，無菌取脾，用塑料針芯輕輕擠壓，磨碎脾臟，收集細(xì)胞懸液，離心棄上

4、清，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗兩次，用RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×106/ml。 三、凋亡的誘導(dǎo) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺炎支原體菌液，高速離心獲取菌體沉淀，PBS洗兩次，用紫外線分光光度法進(jìn)行Mp蛋白定量來確定Mp濃度。將脾淋巴細(xì)胞接種在24孔組織培養(yǎng)板上，分別加入不同濃度(50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml和300μg/ml)的Mp懸液，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組，于37.5℃、5％CO2

5、飽和濕度條件下培養(yǎng)4小時(shí)。 四、凋亡的檢測(cè) 1、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。 2、用AO/EB熒光染色技術(shù)和和Annexin-V FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)分析總淋巴細(xì)胞凋亡率。 3、用PE-Cy5 Rat anti-Mouse CD4標(biāo)記CD4+T淋巴細(xì)胞，Annexin-V FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)亡情況。 4、所有資料用-x±s表示，各組間采用SP

6、SS軟件進(jìn)行方差分析。對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，各實(shí)驗(yàn)組之間再進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、不同劑量Mp體外誘導(dǎo)鼠脾淋巴細(xì)胞4h后，經(jīng)AO/EB染色在熒光顯微鏡下可見大量桔黃色的凋亡細(xì)胞，這些細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：染色質(zhì)濃縮，包膜起泡，出芽，細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀，被染成大小不一、致密濃染的黃綠色顆粒。 2、AO/EB熒光染色及流式細(xì)胞儀二種方法檢測(cè)Mp誘導(dǎo)組總淋巴細(xì)胞凋亡率及CD4+T淋巴細(xì)胞調(diào)亡百分率明顯高于正