同源異型盒基因與人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生、發(fā)展及誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、目的： 涎腺腺樣囊性癌是較為常見的涎腺惡性腫瘤之一，具有浸潤性強，與周圍組織界限不清，術(shù)后易復(fù)發(fā)；易侵入血管，沿血循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點。涎腺腺樣囊性癌目前的治療方法單一，缺乏理論研究基礎(chǔ)，有必要從其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)上進行深入研究，同時探索新的有效的治療方法。 同源異型盒基因家族(H0meobox gene family)是一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因大家族，其在生物特定的發(fā)育階段及特定的組織中表達，編碼一類特殊的

2、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達產(chǎn)物不僅能調(diào)節(jié)所在細(xì)胞的分化，通過調(diào)節(jié)控制信息傳遞相關(guān)分子和多種激素的合成來影響相鄰細(xì)胞間及遠(yuǎn)距離的信息傳遞，從而調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和成熟，而且在成人組織細(xì)胞的增殖、分化過程中也發(fā)揮著主控作用。若同源異型盒基因中某DNA序列發(fā)生突變，就可能導(dǎo)致正常細(xì)胞表型變化而發(fā)生惡變，其異常表達，細(xì)胞將失去分裂增殖的控制，并且不能繼續(xù)分化成熟，從而形成腫瘤。 涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種基因的改

3、變，并與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能及其之間的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。同源異形盒基因作為轉(zhuǎn)錄因子中的一大家族，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有極其重要的作用。 如果找出在涎腺腺樣囊性癌發(fā)病中起作用的關(guān)鍵同源異型盒基因，將對涎腺腺樣囊性癌發(fā)病機制的研究以及涎腺腺樣囊性癌的臨床治療提供一個新的契機。本研究擬采用基因芯片篩選和人涎腺腺樣囊性癌發(fā)病相關(guān)的同源異型盒基因，經(jīng)熒光實時定量PCR技術(shù)(realtime-PCR)定量驗證后，對標(biāo)準(zhǔn)化人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞

4、進行基因轉(zhuǎn)染，檢測癌細(xì)胞生物學(xué)性狀是否改變，以期探索調(diào)控人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生、發(fā)展及誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵基因，為發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在機制提供新思路，新證據(jù)。 方法： (1)設(shè)立6組人“涎腺腺樣囊性癌/癌旁正常腺體組織”及2組“涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞/正常腺體組織”共8組樣本。Trizol法抽提所有標(biāo)本總RNA，純化mRNA，用232種人類同源異型盒基因Oligo探針制成基因芯片，將等量的兩組mRNA樣本分別逆轉(zhuǎn)錄合成熒光標(biāo)記的cDNA混合物

5、探針，與上述基因芯片雜交，經(jīng)嚴(yán)格洗片后，用掃描儀掃描芯片熒光信號圖像，計算機軟件數(shù)據(jù)處理，將所得的數(shù)據(jù)進行比較，找出其中具有共性的異常表達基因，以搜索出可能與涎腺腺樣囊性癌發(fā)生、分化相關(guān)的Homeobox基因。 (2)選取了人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC--2、ACC—M作為實驗組，人正常腺體組織作為對照組，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測3條高度可疑的涎腺腺樣囊性癌相關(guān)基因(TGIF、EVX1和PI

6、TX1)在不同樣本中的mRNA表達水平，通過統(tǒng)計學(xué)分析找出明顯異常表達的Homeobox基因。 (3)構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pEGFP-EVX1，以EVX1為目的基因，采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ACC-M細(xì)胞。實時定量PCR檢測并通過NCBI的BLAST系統(tǒng)的Nucleotide-nucleotide BLAST(blasm)2生行序列比對，對所得基因進行鑒定。轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后進行熒光觀察；同時進行細(xì)胞生長曲線的測定，MTT法檢測細(xì)

7、胞增殖并以細(xì)胞通過8μm孔徑濾膜的能力來判斷細(xì)胞的遷移能力。 結(jié)果： (1)6組組織樣本的試驗組出現(xiàn)上調(diào)的Homeobox基因67條，下調(diào)的Homeobox基因數(shù)量累計共54條；2組細(xì)胞樣本中，出現(xiàn)上調(diào)的Homeobox基因12條，下調(diào)的Homeobox基因數(shù)量15條。同時出現(xiàn)在組織及2組細(xì)胞樣本中的上調(diào)基因1條(TGIF)；下調(diào)基因7條(EVX1、IRX2、EN2、HOP、IPF1、MEIS2及P}iOX2B)。

8、 (2)PITX1在ACC-2、ACC-M與正常腺體組織中的表達均無差異，而TGIF、EVX1在ACC-2及正常腺體組織中的表達量無統(tǒng)計學(xué)差異；在ACC-M與正常腺體組織的表達量有統(tǒng)計學(xué)差異。 (3)將EVX1基因在ACC-M細(xì)胞中增強表達后，生長曲線和MTT法檢測顯示，細(xì)胞的增殖速度明顯降低；轉(zhuǎn)染后能通過8μm孔徑濾膜的ACC-M細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明EVX1的表達增強，導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力降低。 結(jié)論： (1)多