牙鲆和大菱鲆糖代謝及瘦素和脂聯素相關功能的初步研究.pdf

1、本文以我國北方海水養(yǎng)殖肉食性魚類牙鲆（Paralichthys olivaceus）和大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）為研究對象，進行基于氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)的高糖負荷后牙鲆血清代謝組學研究，以及不同飼料糖脂比對大菱鲆瘦素及其受體和脂聯素受體基因表達影響的研究。主要研究內容和結果如下:
　　1.高糖負荷后牙鲆血清代謝組學研究
　　本研究采用基于氣相色譜-質譜聯用技術的代謝組學研究方法，分

2、析兩種不同糖耐量實驗（腹腔注射葡萄糖和口腔灌喂葡萄糖）后牙鲆（225±50g）血清中代謝物變化。結果顯示，兩種不同實驗方式對牙鲆血糖、血清胰島素以及代謝變化影響存在很大差異。牙鲆腹腔注射葡萄糖（500mg/ml，1g/kg體重）后，血糖水平在5h達到峰值（20.06±1.92mM），24h時血糖與0h無顯著差異(P＞0.05);血清胰島素水平在葡萄糖注射后急劇下降，在3h達到最低（1.58±0.21mIU/L），在24h時恢復原值(3.

3、03±0.06mIU/L);與0h相比，注射葡萄糖后3h血清中有6種代謝物水平顯著上調（P＜0.05），分別為:塔羅糖、木糖、異麥芽糖、半乳糖醛酸、羥基脲和環(huán)己烯四醇β環(huán)氧化物;到第5h血清中有9種代謝物水平顯著上調(P＜0.05)，分別為:塔羅糖、木糖、異麥芽糖、黃嘌呤、乳酸、烏頭酸、茉莉酮酸甲酯、環(huán)己烯四醇β環(huán)氧化物和腎上腺皮質酮;3h與5h的血清中只有1種差異代謝物皮質酮(P＜0.05)。牙鲆口腔灌喂葡萄糖(500mg/ml，1.

4、67g/kg體重)后，血糖水平在3h達到最大值（1.90±0.23mM），7h恢復至原來水平（0.89±0.04mM）;而血清胰島素水平在3h上升至3.37±0.34mIU/L，5h時恢復至原水平（2.56±0.41mIU/L）;與0h相比，灌喂葡萄糖后3h時牙鲆血清中顯著上調的代謝物有5種（P＜0.05），分別是:塔羅糖、乳酸、3-羥鄰氨基苯甲酸、黃嘌呤和次黃嘌呤;但在5h時血清中沒有顯著增多的代謝物，只有1種代謝物半乳糖酸含量顯著下

5、降（P＜0.05），而5h時血清中有2種代謝物水平顯著低于3h(P＜0.05)，這2種代謝物是木糖和3-羥鄰氨基苯甲酸。此外，我們還對上述2種不同方式糖負荷后同一時間點的血清代謝物進行了比對，結果顯示在高糖負荷后3h，注射組血清中有4種代謝物水平顯著高于灌喂組(P＜0.05)，分別是:塔羅糖、異麥芽糖、環(huán)己烯四醇β環(huán)氧化物和鄰羥基苯丙酸;5h時注射組血清中有6種代謝物含量顯著高于灌喂組（P＜0.05），分別是塔羅糖、異麥芽糖、木糖、環(huán)己

6、烯四醇β環(huán)氧化物、烏頭酸和半乳糖酸，但有1種代謝物N-氨甲酰谷氨酸含量顯著低于灌喂組（P＜0.05）。經KEGG數據庫比對，以及參考已有報道分析得出，這些差異代謝物表明牙鲆可以通過多種糖代謝途徑進行血糖水平的調節(jié)，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、糖原合成、戊糖與葡萄糖醛酸互變以及戊糖磷酸途徑，同時氨基酸代謝和腸道微生物的代謝也會對血糖變化產生響應，間接起到加速血糖水平下調的作用。值得注意的是血清中鄰羥基苯丙酸和N-氨甲酰谷氨酸水平與機體內瘦素、

7、胰島素、胰高血糖素和生長抑素等激素水平有一定相關性，這兩種代謝物以及皮質酮水平的變化表明，皮質酮、瘦素、胰島素、胰高血糖素和生長抑素等激素可能在牙鲆體內各糖代謝途徑中起到一定的調控作用。
　　2.大菱鲆瘦素及其受體、脂聯素受體基因序列全長克隆和分析
　　在本研究中，利用分子克隆和RACE技術克隆到了大菱鲆瘦素(LEP)及其受體(LEPR)和脂聯素兩種受體（AdipoR1和AdipoR2）eDNA序列全長。大菱鲆LEPcDNA

8、序列全長1126bp，共編碼157個氨基酸。大菱鲆LEP氨基酸序列與人的LEP同源性很低，只有18.8％，但它們預測的三級結構保守性卻很高。大菱鲆LEPR cDNA序列全長4248bp，共編碼1173個氨基酸，大菱鲆LEPR氨基酸序列與人的同源性為28％，與點帶石斑魚的同源性為82％，在脊椎動物中保守存在的所有重要功能域在該序列中均有發(fā)現。組織差異表達結果顯示大菱鲆LEP主要在腦、眼和肝臟中表達，LEPR主要表達的場所是肝臟和腎臟。大菱

9、鲆AdipoR1核苷酸序列全長1125bp，共編碼375個氨基酸，其氨基酸序列與其他脊椎的同源性都很高，人為80％，羅非魚為97％。大菱鲆AdipoR2核苷酸序列全長1940bp，共編碼380個氨基酸，氨基酸序列與其他脊椎動物同源性也都很高，人為78％，羅非魚為92％。蛋白跨膜結構域預測得出大菱鲆AdipoR1和AdipoR2都具有7個明顯的跨膜區(qū)，最優(yōu)拓撲模型為N端在細胞內側模型，與其他脊椎動物相同。大菱鲆AdipoR分布廣泛，Adi

10、poR1在鰓和腎中表達水平最高，AdipoR2則在鰓、胃、腸、腎和幽門盲囊中的表達量都較多，但在肌肉中表達量較少。
　　3.不同飼料糖脂比對大菱鲆瘦素及其受體、脂聯素受體基因表達的影響
　　本研究配制不同糖脂比（1∶6、1∶2、2∶1和14∶1）的飼料，養(yǎng)殖大菱鲆9周后，利用熒光實時定量PCR技術檢測了大菱鲆肝臟中瘦素，肝臟和肌肉中瘦素受體和脂聯素受體基因的表達量。結果顯示，飼料糖脂比從1∶6升高到2∶1對瘦素和瘦素受體基因

11、表達沒有產生顯著影響（P＞0.05），但在糖脂比上升到14∶1時，肝臟瘦素表達量顯著升高（P＜0.05），而肝臟瘦素受體的mRNA水平卻顯著低于對照組（P＜0.05），與其他2組無顯著差異（P＞0.05），此時肌肉中瘦素受體的mRNA水平最高，顯著高于其他3組（P＜0.05）。飼料糖脂比的變化沒有對肝臟中AdipoR的表達產生顯著影響（P＞0.05），然而，與糖脂比為1∶6的對照組相比，大菱鲆肌肉中AdipoR1的表達量在1∶2的處理組