基于生物技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的雷公藤紅素及其類似物抗癌機(jī)制研究.pdf

1、雷公藤紅素（celastrol）是從中藥雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）中提取的活性成分，具有廣泛的藥理作用，有望被開發(fā)成治療慢性炎癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥的新藥。當(dāng)前集中某一通路的研究模式雖然發(fā)現(xiàn)了雷公藤紅素影響了體內(nèi)多種信號(hào)通路，然而對(duì)其缺乏整體的系統(tǒng)性研究，其藥靶和確切的作用機(jī)制尚不明確。此外，由于其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、溶解性差、生物利用度差等問題，限制了其臨床應(yīng)用前景，有必要對(duì)其進(jìn)行

2、相應(yīng)地結(jié)構(gòu)改造，以期得到增效減毒的結(jié)構(gòu)改造物。本課題利用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的細(xì)胞代謝組學(xué)系統(tǒng)研究了雷公藤紅素及其結(jié)構(gòu)改造物NST-001抗人子宮頸癌細(xì)胞的藥理效應(yīng)和作用機(jī)制，并對(duì)相關(guān)的藥理作用機(jī)制理論提出了細(xì)胞代謝層面的解釋。探尋和確立藥物作用的靶點(diǎn)是新藥研究中最為關(guān)鍵的一步，本課題利用新穎的藥物靶點(diǎn)篩選模式“基于藥物親和的靶點(diǎn)穩(wěn)定性篩選技術(shù)”（Drug Affinity Responsive Target Stability，

3、DARTS）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）篩選得到了NST-001的潛在靶點(diǎn)——脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)，并通過分子對(duì)接技術(shù)構(gòu)建了雷公藤紅素及NST-001與脂肪酸合成酶的對(duì)接模擬，間接地驗(yàn)證了脂肪酸合成酶為N

4、ST-001的靶點(diǎn)。
　　 一、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及基于GC-MS技術(shù)的細(xì)胞代謝組學(xué)研究雷公藤紅素抗癌機(jī)制
　　 首先通過生物學(xué)技術(shù)手段證明了雷公藤紅素呈現(xiàn)劑量依賴性抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，能夠激活HeLa細(xì)胞的caspase-3活性，降低細(xì)胞線粒體膜電位。選擇三種藥理機(jī)制明確的細(xì)胞毒性藥物順鉑、多柔比星、紫杉醇作為陽性藥物，利用基于GC-MS的細(xì)胞代謝組學(xué)，多通路全方面監(jiān)控HeLa細(xì)胞經(jīng)雷公藤紅素處理后代謝特征

5、譜的變化規(guī)律。最終結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞三羧酸循環(huán)水平下降，糖酵解上升，能量代謝減緩，氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成、核酸代謝相應(yīng)地受到阻滯，顯示出HeLa細(xì)胞處于凋亡的非正常生理狀態(tài)。本研究為雷公藤紅素的半胱氨酸邁克爾加成反應(yīng)作用機(jī)制假說提供了代謝組學(xué)層面的佐證。
　　 二、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及細(xì)胞代謝組學(xué)研究雷公藤紅素類似物NST-001抗癌機(jī)制
　　 首先通過生物學(xué)技術(shù)手段證明了NST-001保持了雷公藤紅素相似的抗癌活性，能以

6、劑量依賴性抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，并將HeLa細(xì)胞周期阻滯在G2期，能夠激活HeLa細(xì)胞的caspase-3、caSpaSe-9活性，降低細(xì)胞線粒體膜電位，上調(diào)促凋亡因子Bax的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)。此后，利用前期建立好的細(xì)胞代謝組學(xué)方法系統(tǒng)地研究了NST-001的抗癌機(jī)制，結(jié)果顯示，經(jīng)NST-001處理后，HeLa細(xì)胞三羧酸循環(huán)水平下降，糖酵解上升，能量代謝減緩，氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成、核酸代謝相應(yīng)地受到

7、阻滯，反映出HeLa細(xì)胞處于凋亡的非正常生理狀態(tài)。
　　 三、基于DARTS和MALDI-TOF/TOF MS聯(lián)用的NST-001藥靶研究
　　 藥物靶點(diǎn)的篩選和確證是新藥研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，闡明了分子靶點(diǎn)可以清晰徹底地闡明藥物的藥理活性和作用機(jī)制。雖然關(guān)于雷公藤紅素的大量研究揭示了雷公藤紅素參與和調(diào)節(jié)了體內(nèi)各種信號(hào)通路，然而其直接的作用靶點(diǎn)尚未見報(bào)道。本課題通過DARTS藥靶篩選方法篩選NST-001直接靶點(diǎn)，并通過M

8、ALDI-TOF/TOFMS進(jìn)行了鑒定，得到了NST-001的潛在靶點(diǎn)FAS。FAS在多種類型的癌細(xì)胞中都處于高表達(dá)水平，以FAS為藥靶開發(fā)FAS抑制劑可以用作抗癌、抗肥胖藥物。美國(guó)FDA批準(zhǔn)的FAS抑制劑奧利司他(Orlistat)可以通過與FAS中得硫脂酶功能區(qū)域(TE)發(fā)生作用來發(fā)揮其抗癌活性作用。因此利用分子對(duì)接技術(shù)將雷公藤紅素及NST-001與FAS中的TE功能區(qū)域進(jìn)行模擬對(duì)接，結(jié)果顯示，NST-001與雷公藤紅素相比，與TE

9、功能區(qū)域作用力更強(qiáng)，提示NST-001可能是比雷公藤紅素更好的FAS抑制劑。
　　 本課題研究借鑒系統(tǒng)生物學(xué)研究策略，綜合運(yùn)用生物技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)研究中藥活性單體藥理活性和作用機(jī)制，為研究中藥活性單體提供了重要的方法參考。本課題研究建立了一套準(zhǔn)確耐用、快速便捷基于GC-MS的細(xì)胞代謝組學(xué)方法;并利用確證的細(xì)胞代謝組學(xué)方法系統(tǒng)評(píng)價(jià)了雷公藤紅素及其結(jié)構(gòu)改造物NST-001的抗癌活性，為雷公藤紅素與半胱氨酸發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)的作用機(jī)