產(chǎn)α-半乳糖苷酶唾液乳桿菌XH4B篩選、性質(zhì)、應用及高密度培養(yǎng)研究.pdf

1、本課題以中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品為材料，篩選產(chǎn)α-半乳糖苷酶的乳酸菌，并且進行了酶活力及菌種特性研究。經(jīng)相關性分析，確立了菌體生物量與α-半乳糖苷酶活力之間的正相關性，再結合培養(yǎng)基優(yōu)化、生物膜誘導，實現(xiàn)了乳酸菌的高密度培養(yǎng)，獲得了酶活力穩(wěn)定、抗逆性強的全細胞唾液乳桿菌XH4B的α-半乳糖苷酶制劑。
　　通過PY-SE半選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)，結合X-α-Gal顯色及pNPG酶活測定，獲得8株具有較高α-半乳糖苷酶活性的乳酸菌。經(jīng)生理生化鑒定的

2、結果，生長健旺、酶活力高的三株菌分別為:Lactobacillus salivarius XA1R(JX125455)，L.salivarius XH4B(JX125456),Pediococcus acidilactici XS 1B(JQ927329)。充分考慮到菌種本身的生長勢、酶活力，以及我國關于食品中食用菌菌種的規(guī)定，最終確定唾液乳桿菌XH4B用于后續(xù)的研究。
　　對于α-半乳糖苷酶誘導效果最好的碳源是水蘇糖，其次為棉子

3、糖、α-乳糖。采用溶菌酶法提取α-半乳糖苷酶，可以獲得48.2％的酶活;而凍融法、超聲破碎法、蛋白酶法可以獲得25.5～36.1％的酶活力。相對于超聲波法提取的粗酶，超濾純化效率為149.80％，SephadexG200柱層析純化效率為391.91％。最佳酶促反應條件為:檸檬酸緩沖液pH值5.5，離子強度0.15mol/L，反應溫度52℃。該酶以pNPG為底物時的Km值為0.817，以棉子糖為底物時Km值為6.672。僅有K+和Na+對

4、酶活力有正向的激活作用。
　　通過結晶紫染色法及電子掃描顯微鏡觀察，當培養(yǎng)基中存在豆粕浸液(SE)蛋白沉淀時，其中的唾液乳桿菌XH4B傾向于形成懸浮式生物膜，而不是吸附式生物膜。生物膜的形成提高了唾液乳桿菌XH4B對不利環(huán)境的抗性，并且改變了α-半乳糖苷酶的積累趨勢，生物量與酶活力之間的相關性系數(shù)為0.936，建立了生物量與α-半乳糖苷酶活力之間的正相關性，為高密度培養(yǎng)奠定了基礎。
　　以生物量為考察指標時，最好的氮源為酵母

5、粉(4.38g/L)，碳源則是乳糖(5.01g/L)、葡萄糖(4.91g/L)、蔗糖(4.89g/L)。乙酸鈉、檸檬酸鈉及磷酸氫二鈉具有較好的pH值緩沖作用，同時也不會對唾液乳桿菌XH4B生長造成影響。30～50％的PY-SE培養(yǎng)中碳、氮源較為平衡，又有足量的蛋白質(zhì)沉淀可以誘導產(chǎn)生懸浮式生物膜，是最優(yōu)培養(yǎng)基。采用1-2-3補料模式，并且棄去發(fā)酵液組的生物量最高，達到17.89g/L。保留發(fā)酵廢液進行補料時，兩種補料模式(1-2-3)和(

6、3-2-1)并沒有顯著性差異，但是1-2-3的補料模式可以充分稀釋前期發(fā)酵積累的代謝廢物，因此，生物量會稍微高一些。
　　在發(fā)酵豆乳中添加唾液乳桿菌益生菌制劑，水蘇糖和棉子糖的降解效率可以達到90.63％和69.89％，顯著高于(P＜0.05)單純使用唾液乳桿菌XH4B單一發(fā)酵劑的效果。
　　本課題創(chuàng)新性成果包括篩選到α-半乳糖苷酶活力高的唾液乳桿菌XH4B，并且，通過SE對懸浮生物膜的誘導，為乳酸菌發(fā)酵劑高密度培養(yǎng)提供了全