DNA點陣雜交鑒定逆境應答的轉(zhuǎn)錄因子新基因.pdf

1、干旱和高鹽是嚴重影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量的環(huán)境脅迫因子。為了克服逆境對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成的威脅，第一步就是要找到參與逆境應答機制的基因進而探究基因之間的調(diào)控關(guān)系，最終獲得對植物逆境應答機制更全面的理解。 盡管許多研究表明大量轉(zhuǎn)錄因子在植物的各種逆境應答和適應過程中發(fā)揮重要作用。然而，目前在水稻中鑒定出來的與逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目還非常有限。本研究利用一種大規(guī)模研究基因表達的方法──DNA點陣雜交技術(shù)來研究水稻逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

2、 利用已有的水稻ESI數(shù)據(jù)庫、全長cDNA數(shù)據(jù)庫以及水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫，運用生物信息學方法，我們發(fā)現(xiàn)在水稻中至少有2300多個可能的轉(zhuǎn)錄因子（其中一半以上有對應的表達序列），對這些轉(zhuǎn)錄因子按基因家族進行分類。通過比較發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥的轉(zhuǎn)錄因子基因家族的分布在大體上很相似，但在少數(shù)幾個基因家族的數(shù)量和比例上存在明顯差異。 為鑒定參與逆境調(diào)控的新的轉(zhuǎn)錄因子，我們根據(jù)已得到的轉(zhuǎn)錄因子序列，優(yōu)先選擇有對應EST序列的轉(zhuǎn)錄因子設(shè)

3、計特異引物，用PCR方法分離了753個預測為轉(zhuǎn)錄因子的特異片段并制作了DNA點陣膜。用干旱、鹽和ABA脅迫處理下的水稻葉片總RNA做探針，與DNA點陣膜雜交，通過檢測脅迫條件下基因表達的差異來鑒定逆境相關(guān)基因。點陣雜交分析表明，約80％的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因在幼苗葉片中表達，并且苗期的水稻葉片中轉(zhuǎn)錄因子的表達沒有基因家族上的偏好；在干旱、鹽以及ABA脅迫處理下，一共發(fā)現(xiàn)18個轉(zhuǎn)錄因子在至少一個脅迫處理中呈上升表達，29個轉(zhuǎn)錄因子在至少一個

4、脅迫處理中呈下降表達，表達差異的倍數(shù)從2.0到20.5倍不等，共涉及44個獨立的水稻轉(zhuǎn)錄因子，其中的絕大多數(shù)基因尚未報道過受逆境誘導或抑制。 用Northern雜交對選取的5個差異表達的轉(zhuǎn)錄因子進行了驗證和進一步的表達分析，這些轉(zhuǎn)錄因子表達水平的差異倍數(shù)從低（2－3倍）到中（4－6倍）到高（大于8倍）皆有覆蓋。結(jié)果除驗證了DNA點陣雜交結(jié)果的可靠性外，還提供了這5個轉(zhuǎn)錄因子更詳細的脅迫處理后的表達信息。據(jù)此，對它們可能在逆境反應