敲除Dock180重組慢病毒對(duì)大鼠心肌梗死后缺血性心肌病的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討敲除細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)蛋白1（Dock180）重組慢病毒對(duì)大鼠心肌梗死后缺血性心肌病的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建 single guide RNA(sgRNA) Dock180質(zhì)粒，并將其包裝成敲除 Dock180重組慢病毒再進(jìn)行篩選。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制作SD雄性大鼠心肌梗死模型，用此慢病毒感染大鼠心肌梗死灶及其周圍非梗死區(qū)心肌組織，實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)+陰性慢病毒組(Sham+

2、Cas9),假手術(shù)+敲除 Dock180重組慢病毒組,心肌梗死+陰性慢病毒組，心肌梗死+敲除Dock180重組慢病毒組。體外實(shí)驗(yàn)，將此慢病毒感染大鼠 H9C2心肌細(xì)胞株，篩選建立敲除Dock180基因的單克隆H9C2心肌細(xì)胞株，再進(jìn)行低氧處理，實(shí)驗(yàn)分為陰性慢病毒組(Cas9)，敲除 Dock180組，陰性慢病毒低氧組，敲除Dock180低氧組。SD大鼠在術(shù)后第12周時(shí)分別行多普勒超聲測(cè)定心臟結(jié)構(gòu)和功能，并獲取心臟標(biāo)本且稱重，HE染色、苦

3、味酸天狼星紅染色和 TUNEL染色觀察心肌組織學(xué)變化；RT-PCR和免疫組化檢測(cè) Dock180 mRNA和蛋白表達(dá)水平；Western blot檢測(cè) Dock180、p-ERK1/2、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況；MTT和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞的增殖率和凋亡率。
　　結(jié)果：在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，分別較假手術(shù)+陰性慢病毒組和心肌梗死+陰性慢病毒組，假手術(shù)+敲除Dock180重組慢病毒組和心肌梗死+敲除Dock180重組慢病

4、毒的 Dock180 mRNA和蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p-ERK1/2和Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，心臟結(jié)構(gòu)和功能惡化，心肌組織細(xì)胞間質(zhì)的膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）和細(xì)胞凋亡增加(P＜0.05)；并且，在體外實(shí)驗(yàn)中，分別較陰性慢病毒組和陰性慢病毒低氧組，敲除Dock180組和敲除Dock180低氧組Dock180 mRNA和蛋白無(wú)表達(dá)，p-ERK1/2和Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P＜0.