‘白雞冠’茶樹響應(yīng)光調(diào)控的基因差異及理化特征分析.pdf

1、新梢白化茶樹是一種珍稀的種質(zhì)資源，其葉色變化和特異性成分的機(jī)理成為茶葉科研的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。‘白雞冠’作為一種可穩(wěn)定遺傳的白化芽葉茶樹，是茶樹育種的良好材料，對其生理生化和表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究，有助于了解茶樹體內(nèi)的代謝變化及遺傳變異，因而具有較高的研究價(jià)值與實(shí)際意義。本研究以武夷名叢‘白雞冠’茶樹為材料，從生理、生化和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行響應(yīng)光調(diào)控及其葉色形成機(jī)理的研究。首先通過光照和溫度試驗(yàn)，明確‘白雞冠’屬于光照敏感型白化類型。應(yīng)用新一代高通量測序

2、技術(shù)，構(gòu)建‘白雞冠’茶樹轉(zhuǎn)錄組和差異基因表達(dá)譜（DGE），對差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行 GO功能注釋與 KEGG代謝通路分析，富集響應(yīng)光調(diào)控和白化性狀相關(guān)的基因，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)驗(yàn)證差異基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)、檢測葉綠素生物合成相關(guān)的基因表達(dá)；應(yīng)用透射電鏡技術(shù)和酶活性試劑盒觀測葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)和過氧化物酶活性，探明表型與葉綠體發(fā)育、體內(nèi)抗氧化防御酶的關(guān)系；采用分光光度法、高效液相色譜（HPLC）和氣質(zhì)聯(lián)用（GC

3、-MS）技術(shù)檢測兒茶素組分及總量、茶多酚、氨基酸總量和香氣組分，探明‘白雞冠’表型與色素、主要呈味物質(zhì)及香氣的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1.不同光照強(qiáng)度和溫度試驗(yàn)表明，‘白雞冠’屬于光照敏感型白化茶樹，其黃白葉色的形成，需要光照的誘導(dǎo)。
　　2.以‘白雞冠’3天處理組（淡綠色半葉及黃白色半葉，T3d_Z vs. T3d_W）和6天處理組（綠色半葉及黃白色半葉，T6d_Z vs. T6d_W）為材料，基于第二代測序技術(shù)進(jìn)行

4、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq），構(gòu)建了新梢白化茶樹轉(zhuǎn)錄組，共獲得16.1 G clean reads數(shù)據(jù)量和88788條Unigene。與公共數(shù)據(jù)庫比對后，共有35703條Unigene得到注釋，約占總Unigene的40.2％。其中，24846條Unigene通過 GO功能注釋到47個(gè)分類，其中，生物過程的亞層次中，以細(xì)胞過程和代謝過程最多。細(xì)胞組分的亞層次中，注釋到最多的分類為細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器。分子功能的亞層次中，最有代表性的分

5、類是結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性。10213條Unigene通過KOG數(shù)據(jù)庫注釋到26個(gè)基因簇，其中一般性功能預(yù)測簇群代表了最大的類群，其次是翻譯后修飾/蛋白翻轉(zhuǎn)/伴侶蛋白，緊接著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和分泌。此外，脂質(zhì)代謝，細(xì)胞骨架和細(xì)胞壁/細(xì)胞膜生物合成等與細(xì)胞結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的途徑均被注釋。8561條Unigene通過KO注釋到第二層分類的31個(gè)通路，代謝途徑主要包括碳水化合物代謝、能量代謝、脂類代謝、氨基酸代謝和其他次生代謝產(chǎn)物生物

6、合成等；遺傳信息處理注釋到包括折疊、分類和降解、翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)。環(huán)境信息處理注釋到值得進(jìn)一步深入研究的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜運(yùn)輸途徑。1652條Unigene通過Blast2GO軟件注釋分成25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，注釋最多的為MYB轉(zhuǎn)錄因子，AP2結(jié)構(gòu)域，同源異型盒，鋅指蛋白，bZIP家族和bHLH家族。
　　3.差異基因表達(dá)譜（DGE）分析結(jié)果
　　取所有比較組合差異基因集的并集，總共得到6382個(gè)差異基因。3天處理組（T3d_

7、Z vs. T3d_W）具有4072個(gè)顯著性差異表達(dá)基因（上調(diào)1597個(gè)，下調(diào)2475個(gè)）。6天處理組（T6d_Z vs. T6d_W）的差異基因?yàn)?863個(gè)，上調(diào)差異表達(dá)基因比3天處理組多32個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因比3天處理組多759個(gè)。兩個(gè)處理組均表明，下調(diào)差異表達(dá)基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于上調(diào)差異表達(dá)基因。
　　‘白雞冠’綠色半葉對比黃白色半葉，下調(diào)差異基因 GO分類表明，前20的GO分類主要包括細(xì)胞質(zhì)部分、葉綠體、質(zhì)體、核糖體、核糖體合成

8、、核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、翻譯、核糖核蛋白復(fù)合、質(zhì)體部分、葉綠體部分、細(xì)胞成分的生物合成、類囊體、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)的一部分、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞成分的組織或生物合成、細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、葉綠體被膜以及葉綠體發(fā)育相關(guān)、葉綠素捕光蛋白相關(guān)的基因。上調(diào)基因 GO注釋結(jié)果表明，“氧化還原過程”占生物學(xué)過程比例最高；細(xì)胞組分分類中注釋到細(xì)胞周邊和細(xì)胞壁；氧化還原酶活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性 DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的活性在分

9、子功能中占比最大。
　　KEGG代謝通路富集分析表明，3天處理組和6天處理組顯著富集光合作用、卟啉和葉綠素代謝、類胡蘿卜素代謝、類黃酮合成途徑等與葉色密切相關(guān)的代謝通路。此外，脂肪酸代謝及合成、不飽和脂肪酸的代謝（參與膜流動(dòng)性）、氮代謝和次生代謝途徑也顯著富集，這與研究發(fā)現(xiàn)葉綠體膜結(jié)構(gòu)降解、茶多酚及氨基酸成分顯著變化相符。
　　4.處理組間及處理間GO功能DAG富集分析
　　兩個(gè)處理組共有差異基因?yàn)?779個(gè)（上調(diào)92

10、8個(gè)，下調(diào)1851個(gè)），共有上調(diào)差異表達(dá)基因富集到與植物細(xì)胞壁密切相關(guān)的植物型細(xì)胞壁組織和木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性，以及葉綠體被膜功能基因。共有差異表達(dá)基因共鑒定了81個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其中，注釋最多的為 HLH/bHLH轉(zhuǎn)錄因子11個(gè)和 MYB轉(zhuǎn)錄因子8個(gè)。此外，bZIP轉(zhuǎn)錄因子、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、同源異形盒轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子各3個(gè)、NAC轉(zhuǎn)錄因子2個(gè)和Trihelix轉(zhuǎn)錄因子1個(gè)。這些轉(zhuǎn)錄因子家族多與響應(yīng)環(huán)境變化相關(guān)。其中，HY5（屬于

11、bZIP家族）在光響應(yīng)中起重要作用。
　　處理間特有差異表達(dá)基因?yàn)?31個(gè)（上調(diào)42個(gè)，下調(diào)89個(gè)），差異基因多為色素、次生代謝生物合成、光合系統(tǒng)Ⅱ及過氧化物酶體相關(guān)基因。3天處理組、6天處理組和處理間（T6d_Z vs. T3d_Z）共有差異基因?yàn)?2個(gè)。與對照相比，葉綠素生物合成相關(guān)基因谷氨酰-tRNA還原酶（hemA），鎂螯合酶亞基H（CHLH），鎂原卟啉IX甲基酯環(huán)化酶（CRD1），葉綠素酶（E3.1.1.14）均下調(diào)；萜

12、類生物合成相關(guān)基因1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、萜合酶均上調(diào)，且 DXS在遮蔭條件下明顯升高；類黃酮化合物生物合成途徑相關(guān)基因花青素還原酶（E1.3.1.77）、無色花色素還原酶（LAR），類黃酮3’,5'-羥化酶（F3’5’H）均下調(diào)；葉綠體發(fā)育相關(guān)基因鐵氧還蛋白（petF）、Rubisco酶大亞基結(jié)合蛋白（rbcL）均下調(diào)；光系統(tǒng)Ⅱ10kDa蛋白（psbR）、捕光復(fù)合體II的葉綠素a/b結(jié)合蛋白1（LHCB1）上調(diào)，

13、psb27蛋白質(zhì)（psb27）、反應(yīng)中心X蛋白（psbX）下調(diào)；過氧化物酶體相關(guān)基因超氧化物歧化酶（SOD1，Cu-Zn家族）、?；せ蠲妇抡{(diào)。下調(diào)差異表達(dá)基因DAG富集分析表明，最終富集到5個(gè)基因參與光系統(tǒng)II穩(wěn)定、13個(gè)基因參與葉綠體類囊體膜功能和7個(gè)基因參與光系統(tǒng)Ⅱ功能。
　　5. qRT-PCR驗(yàn)證富集通路相關(guān)基因
　　利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證差異基因表達(dá)譜（DGE）數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，3天處理和對照中，JAZ（茉莉

14、酮酸酯ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白）基因與基因表達(dá)譜不相符，其余19個(gè)基因一致；6天處理和對照中，COP1（E3泛素蛋白連接酶）、CHLD（鎂螯合酶D亞基）、CHLI（鎂螯合酶I亞基）基因與基因表達(dá)譜不相符。其余基因的表達(dá)趨勢均與 DGE數(shù)據(jù)相符合?？傮w而言，qRT-PCR檢測結(jié)果與測序結(jié)果的趨勢相一致。
　　以‘白雞冠’和‘肉桂’自然條件下生長的葉片為研究材料，檢測葉綠素代謝途徑相關(guān)基因的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，葉綠素代謝合成相關(guān)基因POR（

15、原葉綠素酸脂還原酶）在響應(yīng)光調(diào)控和葉色形成中起重要作用。
　　6.光照對‘白雞冠’茶樹超微結(jié)構(gòu)及體內(nèi)防御酶的影響研究
　　通過轉(zhuǎn)錄組及基因表達(dá)譜分析表明，GO功能注釋到的基因功能主要與葉綠體發(fā)育、光合作用和過氧化物酶體相關(guān)，因此，以自然條件下和遮蔭條件下的‘白雞冠’葉片為材料，觀測葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)和抗氧化防御酶活性，結(jié)果表明，在強(qiáng)光條件下，‘白雞冠’葉綠體數(shù)目少且超微結(jié)構(gòu)異常，光合膜結(jié)構(gòu)降解，體內(nèi)酶活性低；遮蔭后，‘白雞冠

16、’葉片由黃白色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)重建，恢復(fù)正常形態(tài)，基粒片層結(jié)構(gòu)致密發(fā)達(dá)，體內(nèi)酶活性顯著上升。
　　7.光照對‘白雞冠’茶樹主要色素、呈味物質(zhì)及香氣代謝的影響
　　KEGG代謝通路富集分析富集到的通路主要為卟啉和葉綠素代謝、類胡蘿卜素生物合成、黃酮類化合物生物合成及萜類生物合成途徑，因此，檢測‘白雞冠’葉色變化前后物質(zhì)差異，結(jié)果表明，‘白雞冠’葉色變化前后色素、呈味物質(zhì)和香氣變化明顯?！纂u冠’遮蔭轉(zhuǎn)綠后，Chl