5種人IgG溶血活性及其作用機制的研究.pdf

1、免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）是人血清免疫球蛋白的主要成分，占總免疫球蛋白含量75%以上，是初級免疫應(yīng)答中最持久、最重要的Ig，是唯一能通過胎盤的Ig，在主動、被動免疫中起重要作用。一般認為，非特異性免疫分子和特異性免疫分子之間不存在進化關(guān)系，但近年來學者們研究發(fā)現(xiàn)，眾多無脊椎動物免疫分子不僅具有人Ig的典型功能域，而且具有明顯的分子多態(tài)性，甚至具有部分獲得性免疫學功能。由此提示，非特異性免疫分子和特異性免疫

2、分子之間應(yīng)該存在一定程度的進化關(guān)系，人IgG可能同樣具備某些非特異性免疫學活性。本研究以健康人血清 IgG 為研究對象，采用親和層析、糖組學、蛋白質(zhì)組學、分子生物學的研究技術(shù)，深入探索IgG的溶血活性及其作用機制，所獲主要研究結(jié)果如下：
　　 首先，采用硫酸銨分級沉淀、纖維素DE 52 離子交換層析和親和層析從健康人血清分離 5種人 IgG：IgGg、IgGs-、IgGs+、IgGt-和IgGt+, 其中纖維素DE 52離子交換

3、層析純化的IgG 命名為IgGg；兔抗血藍蛋白小亞基抗體親和層析非特異性洗脫和特異性洗脫所得IgG分別命名為IgGs-和IgGs+；兔抗血藍蛋白總蛋白抗體親和層析非特異性洗脫和特異性洗脫所得IgG分別命名為IgGt-和IgGt+。
　　 1-DE、2-DE和Western-blotting 進一步分析表明，該 5種蛋白確為人IgG，其中IgGg、IgGs+和IgGt+等 3種 IgG 2-DE 圖譜存在較大差異，與IgGg相比，

4、IgGs+和IgGt+分別新增了1、5個蛋白質(zhì)點。
　　 其次，采用苯酚硫酸法、凝集素印跡比較5種人IgG糖基化的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種人IgG總糖含量存在明顯的差異，其中 IgGt+糖含量最高,為82.92 μg/mg,IgGs-糖含量最低，為18.44 μg/mg，前者約為后者的4 倍。進一步研究顯示，5種人 IgG 甘露糖含量亦存在明顯差異，其中 IgGt+甘露糖含量最高，IgGs-甘露糖含量最低，與總糖含量測定結(jié)果一致。由

5、此說明，5種人IgG不僅存在蛋白多態(tài)性差異，而且存在糖基化差異，提示其可能同樣存在免疫學活性的差異。
　　 最后，運用溶血實驗、1-DE、immunoblotting、滲透保護實驗等技術(shù)，對比分析5種人IgG溶血活性的異同，并探索其可能的溶血機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1）5種人IgG 對雞、鼠、兔、人等7種紅細胞的溶血活性存在極顯著性差異，其中IgGs+和IgGt+2種IgG對7種紅細胞均表現(xiàn)出明顯的溶血活性，溶血率為30

6、.99 ± 0.01～100 ± 0.08%,而IgGg、IgGs-和IgGt-等3種IgG對這7種紅細胞幾乎無溶血活性。
　　 2）IgGs+和IgGt+分別經(jīng)胰蛋白酶處理或高碘酸鹽氧化后其溶血活性消失，表明人IgG溶血活性的發(fā)揮既與其蛋白構(gòu)象有關(guān)，也與其糖基化程度高低有關(guān)。
　　 3）進一步采用SDS-PAGE和Immunoblotting分析IgGt+與紅細胞的相互作用，結(jié)果顯示，與用雙蒸水處理的紅細胞相比，IgG

7、t+處理的紅細胞膜電泳后除了有IgGt+重鏈和輕鏈（55 kDa、26 kDa）條帶，還新增一條分子量為121 kDa的高分子量條帶，該條帶亦能與抗人 IgG 抗血清發(fā)生特異性結(jié)合。采用膠內(nèi)蛋白回收法純化該高分子量蛋白，并進行SDS-PAGE和Immunoblotting分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，121 kDa 蛋白電泳后分為66.2 kDa和55 kDa兩條帶，且55 kDa蛋白條帶能與抗人IgG 抗體發(fā)生特異性結(jié)合。這些結(jié)果表明，人IgG 溶

8、血活性的發(fā)揮是通過其重鏈與紅細胞膜緊密結(jié)合所致。
　　 4）滲透保護實驗發(fā)現(xiàn)，PEG可不同程度的阻斷人IgG溶血活性的發(fā)揮，PEG4000 , 6000, 8000對其阻斷率分別為43.75 ± 11.62%、60.41± 1.27%和95.44 ±3.16%。由此可以認為，人IgG溶血作用機制可能為：人IgG分子重鏈通過與紅細胞膜相互作用形成離子滲透孔，引起膠體滲漏而導致溶血。
　　 綜上所述，本課題首次研究發(fā)現(xiàn)人Ig