日本榧樹果實中抑制人婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性成分及其作用機制的研究.pdf

1、目的：日本榧樹(Torreya nucifer L.)是日本、朝鮮和中國特有的一種紅豆杉科植物，其種子有很強的殺蟲活性，在我國和朝鮮用于治療絳蟲感染，在日本民間用作流產(chǎn)藥。關(guān)于日本榧樹的化學(xué)成分研究主要集中在它的葉子和心材上，其根供藥用，具有健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲等功效。本實驗以人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(HEC-1)、人子宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)、人卵巢囊腺癌細(xì)胞株(HAC-2)、人卵巢透明癌細(xì)胞株(HOC-21)和人卵巢透明癌細(xì)胞株(SHI

2、N-3)為材料，研究日本榧樹果實中純化得到的3種二萜類化合物(18-羥基彌羅松酚、kayadiol和花柏酚)對這5種婦科腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，并以HEC-1細(xì)胞為代表，進一步探討kayadiol抑制HEC-1細(xì)胞增殖的作用機制。
　　方法：
　　1. MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))比色法
　　1.1腫瘤細(xì)胞株懸液制備
　　用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整實驗用腫瘤細(xì)胞株濃度為2×105個/mL的細(xì)胞懸液備用。

3、>　　1.2體外抑瘤實驗
　　取對數(shù)生長期的實驗用腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮接種于96孔板，每孔50μL(含1×104個細(xì)胞)，分別加入溶劑對照(終濃度0.1％DMSO)、陽性對照(順鉑)和終濃度為1、10和100μmol/L的5種二萜類化合物各50μL，每組均設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，然后各孔加入5 mg/mL的MTT10μL。培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)孔中上清，每孔加入DMSO150μL，振蕩10 min，

4、充分溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值)，并計算腫瘤細(xì)胞生存率，細(xì)胞生存率(％)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100％。實驗數(shù)據(jù)用The SPSS system V13.0軟件進行處理，受試藥物對細(xì)胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。
　　2.凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分析
　　取對數(shù)生長期的HEC-1細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮接種于8孔Chamber slide，每孔10

5、0μL(含2×104個細(xì)胞)，分別加入溶劑對照(終濃度0.1％DMSO)和終濃度為10μmol/L的kayadiol100μL，置于飽和濕度、37℃和5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h和24 h。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測。每張切片拍攝5個陽性視野，分別計數(shù)每視野正常細(xì)胞數(shù)和帶有熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)，以平均陽性細(xì)胞所占的正常細(xì)胞的百分比作為細(xì)胞凋亡率(apoptotic rate

6、，AR)。
　　3. Western blotting檢測
　　取對數(shù)生長期的HEC-1細(xì)胞，按2×106個細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種。加入終濃度為10μmol/L的順鉑和kayadiol的培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞48 h，離心收集細(xì)胞，PBS漂洗細(xì)胞，加上樣緩沖液100μL，劇烈震蕩后冰浴下超聲波處理1 min。100℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，12000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白濃度。取50μg蛋白在SDS-PAG

7、E電泳下分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(NC膜)，用5％脫脂奶粉于室溫下?lián)u動封閉膜2 h。棄封閉液，用1×TBS-T洗膜3次，每次15 min。膜在抗Bax多克隆抗體(1:500)和抗caspase-3多克隆抗體(1:700)稀釋液中室溫過夜孵育，1×TBS-T洗膜3次，每次15 min，在二抗稀釋液(抗鼠1:5000)中孵育40 min。再次洗膜后加入ECL試劑，反應(yīng)1 min，用X片曝光1-10 min后，顯影。
　　4.半胱天冬酶

8、抑制劑對kayadiol抑制HEC-1細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用
　　取對數(shù)生長期的HEC-1細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮接種于96孔板，每孔50μL(含1×104個細(xì)胞)，分別加入含有半胱天冬酶抑制劑終濃度為1、10和100μmol/L kayadiol和不含半胱天冬酶抑制劑的kayadiol，各50μL，每組均設(shè)3復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，各孔加入5 mg/mL的MTT10μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)孔中上清，每孔加入DMSO150μL

9、，振蕩10min，充分溶解結(jié)晶，測定OD值，并計算細(xì)胞生存率。
　　結(jié)果：
　　1. MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))比色法結(jié)果
　　本實驗采用MTT法探討了3種二萜類化合物(18-羥基彌羅松酚，kayadiol，花柏酚)對5種婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響。18-羥基彌羅松酚、kayadio和花柏酚對5種婦科腫瘤細(xì)胞增值活性有不同的抑制活性。其中kayadio對上述5種細(xì)胞的增殖顯示強的抑制活性，1、10和100μmol/L k

10、ayadio處理的HEC-1細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為69.87％、39.31％和2.76％，對HeLa細(xì)胞，其生存率分別為89.87％、41.31％和6.76％，對HAC-2細(xì)胞，其生存率分別為73.56％、40.15％和17.27％，對HOC-21細(xì)胞，其生存率分別為74.44％、50.90％和11.15％，對SHIN-3細(xì)胞，其生存率分別為69.24％、43.53％和12.49％，均呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系，該化合物10μmol/L組

11、與溶劑對照組相比均具有顯著性的差異(P<0.05)，且100μmol/L組具有非常顯著性的差異(P<0.01)，IC50分別為3.33μmol/L、8.00μmol/L、5.95μmol/L、7.20μmol/L和5.12μmol/L。陽性對照順鉑的IC50分別為15.91μmol/L、34.36μmol/L、38.34μmol/L、44.53μmol/L和5.32μmol/L(Fig.2 and Table1)。
　　2. ka

12、yadiol對HEC-1細(xì)胞凋亡原位標(biāo)記與半定量分析
　　使用10μmol/L的kayadiol處理HEC-1細(xì)胞后，觀察HEC-1細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，溶劑對照組、12 h組和24 h組HEC-1細(xì)胞凋亡率分別為(2.40±1.20)％、(40.16±6.84)％和(86.88±6.00)％，kayadio可明顯誘導(dǎo)HEC-1細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)較好的時間依賴關(guān)系(Fig.3，A and B)。
　　3. kayadio對

13、HEC-1細(xì)胞內(nèi)Bax和caspase-3蛋白的上調(diào)作用
　　為了進一步探討kayadio對HEC-1細(xì)胞內(nèi)Bax和caspase-3蛋白的影響，使用10μmol/L的kayadio處理HEC-1細(xì)胞48 h后，通過Western blotting方法檢測細(xì)胞內(nèi)Bax和caspase-3蛋白的變化。結(jié)果顯示，kayadio作用HEC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)的Bax和caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(Fig.4，A，B and

14、C)。
　　4.半胱天冬酶抑制劑對kayadio抑制HEC-1細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用
　　使用1、10和100μmol/L的kayadio處理HEC-1細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為69.87％、39.31％和2.76％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與kayadio共同孵育HEC-1細(xì)胞后，其細(xì)胞生存率分別為80.78％、36.27％和8.98％，在濃度為1和100μmol/L的細(xì)胞細(xì)胞生存率上升顯著(Fig.5)。