積雪草酸及其稀土配合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用及其線粒體機(jī)制.pdf

1、本論文研究積雪草酸(asiaticacid，AA)及AA—稀土配合物的抗腫瘤作用及其線粒體機(jī)制，并建立一個(gè)篩選抗腫瘤藥物的新平臺(tái)，以轉(zhuǎn)基因酵母篩選經(jīng)線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗腫瘤化合物。 本文用體外清除羥自由基(·OH)試驗(yàn)測定AA及其稀土配合物的抗氧化活性，用MTT法檢測了AA及AA—鈰(AA—Ce)、AA—鋱(AA—Tb)、AA—銪(AA—Eu)對(duì)人肝癌細(xì)胞株(HepG2)、人黑色素瘤細(xì)胞株(B16)、人宮頸癌細(xì)胞株(Hela)

2、以及對(duì)人食管癌細(xì)胞株(Eca109)、人肺腺癌細(xì)胞株(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)增殖的影響，同時(shí)倒置顯微鏡下觀察形態(tài)的變化；采用DCFH—DA檢測胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)含量、ATP試劑盒檢測胞內(nèi)ATP水平、熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位，RT—PCR和WesternBlot法檢測電壓依賴性陰離子通道(voltage—dependentanionchannel，VDAC)表達(dá)量的變

3、化；瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段化；Clark氧電極檢測線粒體呼吸耗氧率的變化；采用Ca2+誘導(dǎo)線粒體腫脹模型，觀察AA、AA—Tb和AA—Eu對(duì)線粒體的直接作用。為進(jìn)一步探討AA與線粒體外膜VDAC的相互關(guān)系，采用野生型釀酒酵母M-3和VDAC缺失型酵母M22-2，通過檢測OD600和細(xì)胞計(jì)數(shù)，比較AA對(duì)兩種酵母細(xì)胞增殖能力的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA能夠抑制三個(gè)腫瘤細(xì)胞株的增殖，并存在劑量依賴性，100μmol/LAA作用細(xì)胞2

4、4h后細(xì)胞突起消失、胞體發(fā)生皺縮、變圓，HepG2細(xì)胞對(duì)AA較為敏感。AA能夠使HepG2線粒體膜電位發(fā)生去極化，劑量依賴性降低胞內(nèi)ATP水平和增加胞內(nèi)ROS含量，50μmol/LAA能夠增加VDAC蛋白的表達(dá)量；另外AA可以劑量依賴性對(duì)抗Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹，表明AA可以直接作用于線粒體。 AA—稀土配合物的主要活性基團(tuán)仍與AA一樣，但其對(duì)Eca109、Hela、A549、MCF-7的增殖抑制作用均強(qiáng)于AA。AA—Tb作用

5、于Hela細(xì)胞可使其DNA發(fā)生片斷化，另外，AA—Tb和AA—Eu均可以引起Hela細(xì)胞呼吸耗氧率的下降，并能對(duì)抗Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹。 5．Fu對(duì)酵母株M-3和M22-2的增殖有抑制作用，但其對(duì)兩種酵母的抑制沒有選擇性。AS2O3與AA對(duì)酵母株M-3的增殖具有顯著的抑制作用，而對(duì)VDAC缺失型酵母M22-2的增殖抑制作用不明顯，說明AS2O3與AA以VDAC為靶點(diǎn)誘發(fā)酵母細(xì)胞凋亡。 總之，AA和AA—稀土配合物均具