歐蓍草中倍半萜內(nèi)酯化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、歐蓍草(Achillea millefolium L.，又名西洋蓍草)，為菊科蓍草屬多年生草本植物，相傳是我國古代伏羲氏用來畫八卦的“神草”。蓍草屬植物共包括100多種，在我國分布廣泛，東北、內(nèi)蒙、新疆等地多見，是一類耐寒耐蔭且對(duì)土壤要求不嚴(yán)的植物。歐蓍草味辛、苦，性寒，民間多用其作消炎、鎮(zhèn)痛、解痙劑，在傳統(tǒng)和現(xiàn)代臨床用藥中常用于治療發(fā)燒，咳嗽，支氣管炎，哮喘，皮膚炎癥和肝病，也可作調(diào)味品和防腐劑。本研究首次以從菊科植物歐蓍草的頭狀花序

2、中分離純化的21種倍半萜內(nèi)酯化合物為對(duì)象，檢測了它們對(duì)五種人肺腫瘤細(xì)胞增殖的作用，篩選出四種可明顯抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖的化合物，并對(duì)化合物Millifolide C抗腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，以期為開發(fā)抗癌活性強(qiáng)、毒副作用低的新型抗腫瘤藥物奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　第一部分歐蓍草中21種倍半萜內(nèi)酯化合物對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性的抑制作用
　　目的:觀察歐蓍草花中分離純化得到的21種倍半萜內(nèi)酯化合物(1)Millifolid

3、e C、(2)isololiolide、(3)6-epiloliolide、(4) artemina、(5) achillininB、(6) achillininC、(7)1α,3α-dihydroxy-7β,11αH-germaera-4Z,10(14)-dien-12,6α-olide、(8)1-hydroxy-2R,3R-isopyliden-hex-5-en-4-one、(9)iso-secotanapartholide、(10

4、) arteludooicinolide A、(11)3-acetyl-iso-secotana-partholide、(12)3-methoxy-anapartholide、(13) secotanapartholide A、(14)secotanapartholide B、(15)5-epi-seco-tanapartholide、(16)4-dehydroxy-1,10-epoxy-AchillininA、(17)4-dehydr

5、oxy-AchillininA、(18) AchillininA、(19)2,3-dihydroxy-Achillinin A、(20) Millifolide A、(21) MillifolideB對(duì)五種人肺腫瘤細(xì)胞增殖的作用，以篩選出具有明顯抑制肺腫瘤細(xì)胞增殖活性的化合物。
　　方法:采用4-甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測21種倍半萜內(nèi)酯化合物對(duì)五種人肺腫瘤細(xì)胞增殖的作用，篩選出具有明顯抗人肺腫瘤細(xì)胞增殖作用的倍半萜內(nèi)酯化合物，

6、并對(duì)藥物的濃度-效應(yīng)曲線以Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計(jì)算藥物的IC50值。
　　結(jié)果:(1)10μmol/L順鉑作用于兩種人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（QG-90和PC-6細(xì)胞）后，對(duì)QG-90和PC-6細(xì)胞顯示非常強(qiáng)的增殖抑制活性，增殖抑制率分別為82.33％和75.29％;10μmol/L的21種倍半萜內(nèi)酯化合物處理QG-90和PC-6細(xì)胞后，化合物1、16、20、21均顯示出強(qiáng)于順鉑的細(xì)胞增殖抑制活性;(2)10μmol/L順鉑作用于三種人

7、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549、RERF-LC-kj和QG-56細(xì)胞)后，對(duì)A549、RERF-LC-kj和QG-56細(xì)胞的增殖抑制率分別為71.02％、44.66％和39.54％，10μmol/L的21種倍半萜內(nèi)酯化合物處理A549、RERF-LC-kj和QG-56細(xì)胞后，化合物1、16、20和21顯示出與順鉑相似或強(qiáng)于順鉑的細(xì)胞增殖抑制活性;(3)化合物2～15和17、18、19對(duì)五種實(shí)驗(yàn)用人肺腫瘤細(xì)胞的增殖無明顯抑制活性(P＞0.05

8、);(4)通過腫瘤細(xì)胞增殖生存率對(duì)化合物1、16、20、21濃度的對(duì)數(shù)回歸方程，得到四種化合物對(duì)五種人肺腫瘤細(xì)胞(QG-90、PC-6、A549、RERF-LC-kj和QG-56細(xì)胞)增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)，除化合物20、21對(duì)A549細(xì)胞的IC50大于10μmol/L外，四種化合物對(duì)五種人肺腫瘤細(xì)胞的IC50均在10μmol/L以下，其中，化合物1和16對(duì)QG-90細(xì)胞的IC50分別為0.12和0.59μmol/L，化合物1對(duì)

9、QG-56細(xì)胞的IC50為0.91μmol/L，化合物21對(duì)PC-6細(xì)胞的IC50為0.19μmol/L。
　　結(jié)論:從歐蓍草的花中分離提取的4種倍半萜內(nèi)酯化合物1、16、20和21對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制活性;愈創(chuàng)木型倍半萜內(nèi)酯化合物抗腫瘤活性與其含有的三元含氧環(huán)密切相關(guān)，三元含氧環(huán)數(shù)量增加，倍半萜內(nèi)酯化合物的抗腫瘤活性顯著增加。
　　第二部分歐蓍草中倍半萜內(nèi)酯化合物Millifolide C抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖

10、作用的機(jī)制
　　目的:大量報(bào)道發(fā)現(xiàn)中草藥中很多成分具有顯著的抗腫瘤活性，并且這些成分多是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。第一部分實(shí)驗(yàn)從歐蓍草的花中篩選出了四種對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用的倍半萜內(nèi)酯化合物。本部分實(shí)驗(yàn)將對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，以明確上述化合物是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。
　　方法:(1)熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測凋亡信號(hào)通路的相關(guān)報(bào)告基因pG13-Luc、p21-Luc、Bax-Luc、hNo

11、xa-Luc與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路的相關(guān)報(bào)告基因SRE-Luc、 IgK-Luc、NFAT-Luc和CRE-Luc的表達(dá);(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測10μmol/L的歐蓍草倍半萜內(nèi)酯化合物Millifolide C作用A549細(xì)胞24h后細(xì)胞的凋亡;(3) Western blot檢測歐蓍草倍半萜內(nèi)酯化合物Millifolide C作用A549細(xì)胞后p53、Bax及Caspase-3的變化;(4)MTT法檢測半胱天冬酶抑制劑對(duì)Millifoli

12、deC抑制人肺癌細(xì)胞A549增殖的翻轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)果:(1)10μmol/L的四種蓍草倍半萜內(nèi)酯化合物1、16、20、21處理A549細(xì)胞，觀察其對(duì)A549細(xì)胞報(bào)告基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，化合物1可明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞內(nèi)p53依賴的凋亡信號(hào)通路的相關(guān)報(bào)告基因pG13-Luc、p21-Luc、Bax-Luc、hNoxa-Luc的表達(dá)，而對(duì)其他信號(hào)通路的相關(guān)報(bào)告基因SRE-Luc、IgK-Luc、NFAT-Luc和CRE-Luc不

13、顯示誘導(dǎo)活性，而另外三種化合物，除化合物21對(duì)pG13-Luc有明顯的誘導(dǎo)作用外，對(duì)其他報(bào)告基因均不顯示誘導(dǎo)作用。(2) Millifolide C對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響:10μmol/L的Millifolide C處理A549細(xì)胞24 h后，A549細(xì)胞凋亡率為（25.0±3.7）％，與空白對(duì)照組（5.8±0.3）％比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，提示Millifolide C對(duì)A549細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用。(3)Millif

14、olide C對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)p53蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白的上調(diào)作用:10μmol/L的順鉑和Millifolide C作用A549細(xì)胞后，均可明顯上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的p53、Bax和Caspase-3表達(dá)。(4)半胱天冬酶抑制劑對(duì)MillifolideC抑制細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用:0.1、1、10μmol/L的順鉑和Millifolide C處理A549細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為95.10％、73.66％、28.27％和70.82

15、％、29.87％、3.64％;20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與順鉑和Millifolide C共同處理A549細(xì)胞后，其細(xì)胞生存率明顯上升，分別為100.00％、80.90％、56.34％和84.79％、49.67％、17.05％，半胱天冬酶抑制劑能顯著翻轉(zhuǎn)Millifolide C對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用。
　　結(jié)論:歐蓍草倍半萜內(nèi)酯化合物Millifolide C對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞A549細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡活性;Millif