瘢痕疙瘩1號染色體短臂微衛(wèi)星雜合性缺失的研究分析及精細(xì)作圖.pdf

1、[目的]
　　 大量的遺傳流行病學(xué)研究和分子遺傳學(xué)研究均表明，瘢痕疙瘩的形成與遺傳具有非常密切的關(guān)系。尋找瘢痕疙瘩的相關(guān)調(diào)控基因已成為當(dāng)前瘢痕研究的熱點(diǎn)之一。因此深入研究以期從基因水平闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制，篩選出瘢痕疙瘩形成或抑制的相關(guān)調(diào)控基因，為臨床研究和指導(dǎo)臨床治療提供線索和依據(jù)顯得十分必要。既往研究顯示，1號染色體的短臂末端匯集了許多與細(xì)胞生長、增殖、分化相關(guān)的基因，已有大量報道在許多腫瘤中該區(qū)存在缺失，其缺失頻率位于3

2、6％～80％之間。本課題組在前期研究中應(yīng)用比較基因組雜交(comparativegenomic hybridization，CGH)分析結(jié)果示瘢痕疙瘩1號染色體短臂存在DNA拷貝數(shù)高頻率缺失。隨后進(jìn)一步尋找1號染色體短臂末端存在的瘢痕疙瘩相關(guān)調(diào)控基因示1pter-36.21區(qū)域的D1S243-D1S468-D1S507為瘢痕疙瘩的LOH缺失區(qū)域。且D1S507位點(diǎn)出現(xiàn)高頻率缺失，提示該處存在與瘢痕疙瘩相關(guān)的單個或多個抑制基因。DNA測序

3、(DNA sequencing)技術(shù)是一種最為精確的分子診斷技術(shù)，在遺傳性疾病和腫瘤的診斷領(lǐng)域內(nèi)占有重要地位，目前主要應(yīng)用于鑒定基因、檢測突變、分析噬菌體文庫等方面。因此，本研究在對1號染色體短臂末端缺失最明顯的區(qū)域(D1S468-D1S507區(qū)域)作微衛(wèi)星雜合性缺失的分析及DNA序列測定，以探索瘢痕疙瘩相關(guān)基因DNA序列的變化，篩選出瘢痕疙瘩形成相關(guān)的調(diào)控基因，進(jìn)一步精確繪制圖譜及分析將可能找出潛在的瘢痕抑制基因(scarsuppre

4、ssor gene，SSG)的丟失區(qū)域，從基因水平闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制，為最終揭開瘢痕疙瘩形成的奧秘，尋求瘢痕疙瘩最有效的防治方法打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 在經(jīng)瘢痕疙瘩染色體變異頻率圖譜和微衛(wèi)星多態(tài)分析證實(shí)的DNA拷貝數(shù)高頻率缺失的1號染色體短臂末端區(qū)域(D1S468-D1S507區(qū)域)，選取最大雜合度為65％以上的微衛(wèi)星標(biāo)記13個：D1S468、D1S2845、D1S2660、D1S2633、D1S26

5、42、D1S2663、D1S2694、D1S508、D1S450、D1S2736、D1S2667、D1S228、D1S507。收集6例患者瘢痕疙瘩組織和血液標(biāo)本，分別抽提出相應(yīng)基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，回收純化后進(jìn)行基因組DNA測序，以軟件DNAStar、GeneScan、Genotyper分析，將瘢痕疙瘩組織的DNA序列分別與血液和Genebank的對應(yīng)序列進(jìn)行比較、分析各微衛(wèi)星位點(diǎn)的LOH情況。

6、r>　　 [結(jié)果]
　　 研究顯示，所選取的13個微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在血液標(biāo)本中均未發(fā)現(xiàn)突變。而瘢痕疙瘩組織經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)有多個LOH，而且是多位點(diǎn)、多類型的。D1S2845和D1S450的突變率均為83.3％(5/6)，其次為D1S2663，突變率為66.6％(4/6)。D1S468、D1S2660、D1S2633、D1S2667、D1S507的突變率均為50％，突變率最低的為D1S2694和D1S2736為33.3％。其中D1

7、S2642、D1S508、D1S228的統(tǒng)計數(shù)據(jù)P>0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 瘢痕疙瘩組織選取的13個微衛(wèi)星位點(diǎn)中均發(fā)生不同程度的雜合性缺失，有10個發(fā)生突變，其中D1S2845和D1S450發(fā)生高頻突變，以AC堿基缺失及G/A轉(zhuǎn)換為主。D1S2845中移碼突變占60％，點(diǎn)突變占40％。D1S450中移碼突變占43.4％，點(diǎn)突變占56.6％，堿基突變導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成，提示D1S2845和D1S4