新生食管再血管化的病理組織學(xué)研究——VEGF、Endostatin、CD105、CD34及MVD在新生食管不同時段的表達變化.pdf

1、研究背景： 人工食管研究一直是食管重建外科的熱點研究方向，1952年Berman等[1]利用橡膠管構(gòu)建人工的實驗開辟了人工食管研究的先河，近半個多世紀(jì)以來國內(nèi)外學(xué)者采用多種材料進行人工食管的構(gòu)建取得了長足的進展，因新生食管再生及術(shù)后狹窄而制約了人工食管的進一步臨床應(yīng)用。 前期的動物實驗[2-5]的病理大切片觀察表明，人工食管植入犬體內(nèi)后可誘導(dǎo)出新生食管再生，并可觀察到較完整的上皮化過程及部分高級結(jié)構(gòu)(肌層、腺體等)的再生

2、，同時，在新生食管組織中還可以看到部分血管生成。在此過程中，再血管化是新生食管得以存活、重塑的關(guān)鍵所在，本研究擬通過免疫組織化學(xué)方法研究不同促血管生成及調(diào)節(jié)因子參與新生食管再血管化的過程及機制。 1、材料與方法： 1.1人工食管的構(gòu)建、動物模型建立及人工食管植入 選取健康豬(由廣東冠吳生物有限公司提供，檢疫4周)的主動脈為原材料進行清洗，以環(huán)氧交聯(lián)法進行組織處理，并以氨基酸溶液進行漂洗及表面修飾，將處理后的豬主動

3、脈剪制成長方形的片狀材料，并在潔凈工作臺下以4/0平制羊腸線縫制成內(nèi)徑2.0cm，壁厚0.5cm，長8～12 cm的人工食管，以生理鹽水封存于密封膠袋中經(jīng)60Co照射消毒后備用。 1.2標(biāo)本取材、切片及染色 1.2.1標(biāo)本來源將前期動物實驗(人工食管植入后誘導(dǎo)犬新生食管再生的實驗動物模型)的新生食管大切片標(biāo)本進行取材，分別對3、6、12、24個月的新生食管標(biāo)本各一例進行7個部位(原犬食管、吻合口上緣、新生食管上段、中段、

4、下段、吻合口下緣、原犬胃)的取材，并進行石蠟包埋、切片等備用。 1.3方法： 1.3.1免疫組化： 應(yīng)用免疫組化法檢測3、6、12、24個月的4例實驗犬之新生食管的共計28個部位的組織標(biāo)本中VEGF、endostatin的表達情況，用CD105、CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞。 1.3.2觀測指標(biāo)： 1.3.2.1觀察VEGF、endostatin的表達情況； 1.3.2.2觀察CD105、CD

5、34的表達情況； 1.3.2.3檢測MVD。 1.3.2免疫組化結(jié)果判斷參照病理科免疫組織化學(xué)閱片常規(guī)。 1.3.3測定微血管密度(micro vessel density，MVD)參照Weidner法[7]。 1.4統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS15.0軟件包進行處理，組間比較用方差分析，非連續(xù)性變量以秩和檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2、結(jié)果 2.1標(biāo)本的取材制備

6、 本組資料中共取材28份(4個不同時段*7個不同部位)，免疫組化制片共112張，即VEGF片28張，endostatin片28張，CD105片28張，CD34片28張。 2.2 IHC鏡下情況 2.2.1 IHC檢測的大體情況(血管生成的大體情況) 人工食管植入后3個月、6個月、12個月、24個月，在新生食管組織中都可以觀察到毛細血管存在。3個月的新生食管組織中可以看到新生血管主要位于粘膜層及外膜層，所形成毛細血

7、管大部分為一層不連續(xù)血管內(nèi)皮細胞圍成，甚至為數(shù)個內(nèi)皮細胞組成的細胞簇，缺乏結(jié)締組織，結(jié)構(gòu)欠佳；6個月者可以在粘膜層、肌層及外膜層看到管壁由多層血管內(nèi)皮細胞組成，管腔結(jié)構(gòu)較3個月者成熟，管腔內(nèi)可見紅細胞，其微血管密度明顯較3個月者大，但未見到管腔結(jié)構(gòu)成熟的細小血管；12個月、24個月者在粘膜層、肌層、外膜層均可觀察到毛細血管網(wǎng)，毛細血管管腔結(jié)構(gòu)完整，并可以看到部分管壁肌層較發(fā)達的細小血管。 2.2.2 VEGF表達情況 本

8、組資料中，VEGF的表達情況較好，在3個月、6個月、12個月、24個月的上皮組織及部分肌組織中可以觀察到陽性表達，部分為強陽性表達，但兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 2.2.3 endostatin表達情況 本組資料中，endostatin為陰性表達； 2.2.4 CD105表達情況 本組資料中，CD105在不同時段不同部位的血管內(nèi)皮細胞胞漿中均有不同程度的表達，其中在6個月、1

9、2個月的部分標(biāo)本中可觀察到強陽性表達。 2.2.5 CD34表達情況 本組資料中，CD34為陰性表達 2.2.6 MVD表達情況 2.2.6.1不同時段MVD的變化情況 從附圖3-16-3-20可以看出，3、6、12、24個月的7個部位依次比較，可以看出，原犬食管、原犬胃的微血管密度無差異，隨著時間的向前推移，新生食管的上、中、下段呈現(xiàn)出血管慢慢成熟的過程，即由單個內(nèi)皮細胞或數(shù)個內(nèi)皮細胞圍成的毛細

10、血管到管腔富有較厚肌層的小血管。在此過程中，可以看出3個月時，生成之血管尚不成熟，6個月時生成之血管略顯成熟，12個月、24個月時生成之血管結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定，新生食管的微血管密度相差不大，差異僅表現(xiàn)為24個月時的新生食管組織中血管的管腔更顯成熟。由于本組資料中樣本量較小，故各組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 2.2.6.2同一時段新生食管不同部位MVD的變化情況 分別對3、6、12、24個月的標(biāo)本群做比較，可