隨機(jī)掃描光刺激系統(tǒng)研究.pdf

1、多細(xì)胞或多神經(jīng)突起的選擇性激活對(duì)于研究神經(jīng)元整合、神經(jīng)元計(jì)算非常重要。近幾年,基因工程與光刺激技術(shù)結(jié)合,推動(dòng)了一項(xiàng)新技術(shù)光遺傳技術(shù)的誕生,它可以快速、無(wú)損、精確地激活表達(dá)光敏感通道的細(xì)胞,進(jìn)而選擇性地控制特定神經(jīng)元或局部神經(jīng)環(huán)路的活動(dòng)。目前熒光顯微鏡使用的光源大都是寬場(chǎng)光源,進(jìn)行光刺激時(shí)會(huì)把整個(gè)視場(chǎng)中的所有細(xì)胞或整個(gè)神經(jīng)環(huán)路激活。激光掃描顯微鏡通過(guò)掃描鏡實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞的選擇性激活,但由于掃描鏡內(nèi)在的固有慣性,限制了掃描速度和多個(gè)位置的選取。

2、最近,空間光調(diào)制器被引入顯微鏡系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了無(wú)慣性的選擇性激活,但其較低的刷新頻率和衍射效率限制了該技術(shù)的應(yīng)用。相比而言,聲光偏轉(zhuǎn)器具有隨機(jī)尋址能力,能夠快速無(wú)慣性引導(dǎo)激光到任意位置,良好的空間選擇性使得聲光偏轉(zhuǎn)器非常適合多細(xì)胞選擇性激活。
　　為了實(shí)現(xiàn)以上目的,本文首先利用聲光偏轉(zhuǎn)器作為光束掃描器件,結(jié)合現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡技術(shù),建立了獨(dú)立的隨機(jī)光刺激系統(tǒng),相關(guān)的工作主要有:
　　(1)在光路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中,采用二維聲光偏轉(zhuǎn)器實(shí)現(xiàn)激光

3、光束的二維掃描,并采用通用光學(xué)器件、光學(xué)調(diào)節(jié)架實(shí)現(xiàn)與顯微鏡系統(tǒng)耦合,實(shí)現(xiàn)生物樣品顯微放大、可視化處理,引導(dǎo)激光刺激期望的細(xì)胞或神經(jīng)元;在機(jī)械設(shè)計(jì)中,采用模塊化設(shè)計(jì)思想,使得系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊,方便與各種商用顯微鏡系統(tǒng)耦合;為控制聲光偏轉(zhuǎn)器工作,設(shè)計(jì)了驅(qū)動(dòng)電路,它包括標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)采集卡、開關(guān)電源和控制電路,用于數(shù)據(jù)傳輸和與其它外設(shè)通信;基于LabVIEW應(yīng)用軟件,開發(fā)一套獨(dú)立的應(yīng)用控制軟件,擁有多種刺激模式,軟件可讀性好,操作方便。
　　(

4、2)測(cè)試了隨機(jī)光刺激系統(tǒng)的工作性能,單點(diǎn)最快時(shí)間可以達(dá)到10μs。在40倍物鏡下,刺激光斑為1.38μm,刺激范圍為164μm。光刺激功率波動(dòng)<5％,刺激定位誤差小于1％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明系統(tǒng)具備多點(diǎn)快速激活的能力,系統(tǒng)工作穩(wěn)定,具有很好的重復(fù)性。
　　其次,為了分析測(cè)試系統(tǒng)的激活模式與激活效果以及開展生物學(xué)應(yīng)用,與上海神經(jīng)所的章曉輝研究員、王佐仁研究員兩課題組展開合作研究,主要的工作有:
　　(1)利用表達(dá)有光敏感通道的HEK

5、293細(xì)胞和海馬神經(jīng)元,證明系統(tǒng)在10ms內(nèi)可以激活細(xì)胞和誘導(dǎo)出動(dòng)作電位。提出刺激光功率決定系統(tǒng)刺激的空間分辨率,并證明在一定的功率條件下,系統(tǒng)能夠激活單細(xì)胞而不會(huì)激活周圍其它細(xì)胞,顯示系統(tǒng)具備局部激活能力,而采用雙光子激發(fā)將能夠提高系統(tǒng)的空間分辨率,便于實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞激活。分析了點(diǎn)刺激模式與區(qū)域刺激模式的不同,提出采用區(qū)域刺激模式可以顯著提高去極化峰值電流、動(dòng)作電位的誘導(dǎo)頻率及誘導(dǎo)成功率。提出對(duì)于區(qū)域刺激模式,采用隨機(jī)掃描方式比順序掃描方

6、式和環(huán)形掃描方式更有效激活細(xì)胞。隨機(jī)光刺激系統(tǒng)能夠在微秒水平控制激光刺激多個(gè)位置,刺激時(shí)間、刺激間隔、刺激位置、刺激強(qiáng)度等可精準(zhǔn)調(diào)控,是一種超靈活、多模式調(diào)控細(xì)胞或神經(jīng)元的工具。
　　(2)利用隨機(jī)光刺激系統(tǒng),對(duì)小鼠體感皮層神經(jīng)環(huán)路和果蠅嗅覺系統(tǒng)進(jìn)行了光刺激試驗(yàn),證明系統(tǒng)適用于不同尺寸細(xì)胞的光刺激,系統(tǒng)可以選擇性激活多個(gè)細(xì)胞,可以模擬神經(jīng)元多個(gè)信號(hào)輸入,進(jìn)行神經(jīng)元運(yùn)算研究和信息整合研究,有利于揭示單個(gè)神經(jīng)元和特定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能,證